Mfn2在TGF-β2诱导的晶状体上皮细胞上皮-间质转化中的作用△

于童 张劲松

白内障是一种常见的致盲性眼病，发病率不断上升，目前手术是其唯一有效的治疗方法。白内障超声乳化吸出术虽然能在很大程度上改善患者的视觉质量，但是术中残留的人晶状体上皮细胞(human lens epithelial cells，HLECs)在白内障术后发生的上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)会导致后发性白内障发生。YAG激光后囊切开术虽可对后发性白内障进行有效的治疗，但其导致的多种并发症如眼内炎、视网膜脱离、人工晶状体(intraocular lens，IOL)偏位等影响患者的生活质量[1]。1982年Greenburg等[2]通过将LECs在胶原凝胶中培养发现，上皮细胞具有间质细胞的形态，由此提出了EMT的概念，其在胚胎发育、多种纤维化疾病及癌症转移中均起重要作用。在EMT的过程中，原本紧密相连的上皮细胞的细胞间黏附分子，如E-钙黏蛋白(E-Cadherin)的表达减少，丧失了与基底膜的连接并逐渐失去上皮细胞表型，而间质细胞迁移与侵袭能力增强，同时波形蛋白(Vimentin)表达增加,从而逐渐获得间充质特征。转化生长因子β2(transforming growth factor β2，TGF-β2)可以成功诱导LECs发生EMT，且经过TGF-β2处理的LECs可以作为EMT的细胞模型[3]。线粒体融合蛋白基因2(mitofusin 2，Mfn2)是存在于线粒体外膜上高度保守的GTP酶，是参与线粒体外膜融合的重要蛋白之一，并与细胞及细胞器多种生物学功能密切相关，它除了参与调控线粒体形态结构外，还与细胞代谢、增殖、凋亡、内质网应激、自噬等有关[4]。有关Mfn2与LECs发生EMT的关系的报道尚少。本研究通过分别检测TGF-β2作用下HLECs内Mfn2的表达差异和Mfn2过表达对HLECs的影响，来探讨Mfn2对TGF-β2诱导的LECs发生EMT的作用。

1 材料与方法

1.1 材料HLECs细胞系(SRA01/04)由中国医科大学附属第四医院眼科晶状体实验室提供；人TGF-β2(Human TGF-β2-Mammalian)、山羊抗兔二抗(美国PeproTech公司)；pEGFP-Mfn2质粒合成(武汉金开瑞生物工程有限公司合成)；RNAiso(美国Invitrogen公司)；PrimerScriptTMRT 5酶混合液、SYBRPremix Ex Taq II(日本Takara公司)；兔抗人Mfn2、Vimentin、E-Cadherin抗体(英国Abcam公司)；ABI 7500实时荧光定量PCR系统(美国Applied Biosystems公司)；荧光显微镜(日本Olympus公司)。

1.2 方法将TGF-β2作用24 h的HLECs作为TGF-β2处理组，转染pEGFP-Mfn2的HLECs作为转染组，自然生长不做处理的HLECs作为对照组。

1.2.1 细胞培养和处理将冻存的HLECs SRA01/04复苏后接种于含体积分数10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素和100 μg·mL-1链霉素的培养基中，置37 ℃、含体积分数5%CO2培养箱中培养，待细胞长到90%融合时用含2.5 g·L-1EDTA的胰蛋白酶消化传代。传代三次以上后取同代且生长状态良好的细胞进行实验。分别用浓度为10 ng·mL-1、50 ng·mL-1、100 ng·mL-1的TGF-β2作用于HLECs 24 h作为TGF-β2处理组，用于后续实验。

1.2.2 实时荧光定量PCR检测RNAiso plus试剂提取细胞内总RNA，Nano drop检测RNA浓度。利用RT 5酶混合液反转录获得cDNAs，以GAPDH作为内参。Mfn2引物序列:上游引物:5’-TCAGAGCCCGAGTACATGGA-3’，下游引物:5’-CGTTGAGCACCTCCTTAGCA-3’；E-Cadherin引物序列:上游引物:5’-GAAAGCGGCTGATACTGACC-3’，下游引物:5’-CGTACATGTCAGCCGCTTC-3’；Vimentin引物序列:上游引物:5’-GAGAACTTTGCCGTTGAAGC-3’，下游引物:5’-TCCAGCAGCTTCCTGTAGGT-3’；GAPDH引物序列:上游引物：5’-CGGATTTGGTCGTATTGGG-3’，下游引物：5’-TGCTGGAAGATGGTGATGGGATT-3’，反应体系20 μL。采用ABI 7500进行实时荧光定量PCR反应，经过3次独立实验，采用 2-ΔΔCt法定量分析TGF-β2处理组、转染组、对照组的Mfn2、E-cadherin和Vimentin的mRNA相对表达量，Graphpad prism 5作图并进行统计学分析。

1.2.3 细胞转染转染前1 d将HLECs按后续实验需要分别接种于6孔板和24孔板，并分为转染组和对照组。6孔板细胞铺板于2 mL含血清、不含抗生素的培养基中；24孔板细胞铺板于500 μL含血清、不含抗生素的培养基中。细胞达到50%融合时，6孔板转染组每孔加入10 μL Lipofectamine2000和4 μg pEGFP-Mfn2进行转染；24孔板转染组每孔加入2 μL Lipofectamine2000和0.8 μg pEGFP-Mfn2进行转染。6 h后，更换为含有血清的全培养基，在37 ℃、含体积分数5%CO2培养箱中培养48～72 h后检测转染水平进行后续实验。

1.2.4 免疫荧光细胞化学检测实验前将细胞铺板爬片并进行所需处理，实验第1天在培养板中将已爬好细胞的玻片用PBS清洗后，用40 g·L-1多聚甲醛固定15 min。体积分数0.5%TritonX-100室温通透20 min，再用PBS清洗3次，滴加山羊血清封闭30 min。滴加稀释好的兔抗人一抗4 ℃孵育过夜。实验第2天滴加稀释好的荧光山羊抗兔二抗，避光20～37 ℃孵育1 h。滴加DAPI避光孵育5 min，PBST清洗后用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，在荧光显微镜下观察并采集图像。检测TGF-β2处理组、转染组与对照组的Mfn2、E-Cadherin和Vimentin蛋白表达变化。

1.3 统计学方法采用SPSS 17.0统计学软件对数据进行分析。数据用均数±标准差表示。两样本比较采用t检验。检验水准：α=0.05。

2 结果

2.1 TGF-β2处理组和对照组HLECs中Mfn2表达变化

2.1.1 TGF-β2处理组和对照组HLECs中Mfn2 mRNA表达变化实时荧光定量PCR检测结果显示，不同浓度TGF-β2(10 ng·mL-1、50 ng·mL-1、100 ng·mL-1)处理HLECs 24 h后，TGF-β2处理组Mfn2 mRNA表达量较对照组(0 ng·mL-1TGF-β2)均升高，差异均有统计学意义(均为P<0.001)。其中当TGF-β2浓度为100 ng·mL-1时，Mfn2 mRNA表达量升高最明显，见图1。因此，选取100 ng·mL-1TGF-β2作为后续实验的细胞最佳处理浓度。

图1 TGF-β2处理组和对照组HLECs中Mfn2 mRNA TGF-β2浓度表达量变化 与对照组比较，**P

2.1.2 TGF-β2处理组和对照组HLECs中Mfn2蛋白表达变化免疫荧光细胞化学检测结果显示，细胞内Mfn2(红色)荧光亮度增强，数量增加，反映经最佳浓度100 ng·mL-1TGF-β2处理后，TGF-β2处理组Mfn2蛋白表达较对照组增加，见图2。

图2 TGF-β2处理组和对照组HLECs中Mfn2蛋白表达变化 HLECs核呈蓝色荧光(DAPI)，Mfn2蛋白呈红色荧光。A：对照组；B：TGF-β2处理组

2.2 TGF-β2处理组和对照组HLECs中上皮标志物变化

2.2.1 TGF-β2处理组和对照组HLECs中E-Cadherin和Vimentin的mRNA表达变化实时荧光定量PCR检测结果显示，100 ng·mL-1TGF-β2处理组处理细胞24 h后，TGF-β2处理组与对照组相比E-Cadherin mRNA表达量下降，差异有统计学意义(P<0.001)，Vimentin mRNA表达量升高，差异有统计学意义(P<0.001),见图3。说明在100 ng·mL-1TGF-β2作用细胞24 h后，在mRNA表达水平HLECs发生了EMT。

2.2.2 TGF-β2处理组和对照组HLECs中E-Cadherin和Vimentin的蛋白表达变化免疫荧光细胞化学检测结果显示，100 ng·mL-1TGF-β2处理组处理细胞24 h后，细胞内E-cadherin(绿色)荧光亮度降低，数量减少，反映了TGF-β2处理组E-Cadherin蛋白表达较对照组下降，Vimentin(红色)荧光亮度增强，数量增加，说明TGF-β2处理组较对照组Vimentin蛋白表达增加，见图4。即100 ng·mL-1TGF-β2作用24 h，在蛋白水平HLECs发生了EMT。

2.3 Mfn2转染后转染组和对照组HLECs上皮标志物变化

2.3.1 Mfn2转染后转染组和对照组E-Cadherin和Vimentin mRNA表达变化实时荧光定量PCR检测结果显示，pEGFP-Mfn2转染HLECs后，转染组Mfn2 mRNA表达量较对照组明显升高，差异具有统计学意义(P<0.001)。从mRNA水平证明pEGFP-Mfn2转染使Mfn2成功过表达，见图5。转染组E-Cadherin mRNA表达量较对照组下降，Vimentin mRNA表达量较对照组升高，差异均有统计学意义(均为P<0.001)，见图6。从mRNA水平证明了过表达Mfn2可使HLECs发生EMT。

2.3.2 Mfn2转染后转染组和对照组HLECs中E-Cadherin和Vimentin蛋白表达变化免疫荧光细胞化学检测结果显示，细胞内Mfn2(红色)较对照组荧光亮度增强，数量增加，在蛋白水平反映了pEGFP-Mfn2转染HLECs后，转染组与对照组相比Mfn2蛋白成功过表达。且与对照组相比，转染组E-Cadherin(绿色)荧光强度减弱，表达明显减少，Vimentin(红色)荧光亮度增强，表达明显增加，见图7。说明在蛋白表达水平，过表达Mfn2可使HLECs发生EMT。

图3 TGF-β2处理组和对照组HLECs中E-Cadherin和Vimentin mRNA表达量变化 两组间比较，**P

图4 TGF-β2处理组和对照组HLECs中E-Cadherin和Vimentin的蛋白表达变化 HLECs核呈蓝色荧光(DAPI)，E-Cadherin呈绿色荧光,Vimentin呈红色荧光

图5 pEGFP-Mfn2转染HLECs后转染组与对照组Mfn2 mRNA表达变化 与对照组比较，**P

图6 pEGFP-Mfn2转染HLECs后转染组与对照组E-Cadherin和Vimentin的mRNA表达变化 两组间比较，**P

图7 pEGFP-Mfn2转染HLECs后转染组与对照组Mfn2、E-Cadherin和Vimentin的蛋白表达变化 HLECs核呈蓝色荧光(DAPI)，Mfn2和Vimentin呈红色荧光，E-Cadherin呈绿色荧光

3 讨论

Mfn2是参与线粒体外膜融合的重要蛋白之一，Mfn2与细胞及细胞器多种生物学功能均存在着密切的关系。随着研究的不断深入，Mfn2在多种疾病的发生发展中发挥的作用也越来越受到关注。已有研究表明，在肾间质纤维化过程中，Mfn2 mRNA的表达量明显升高[5]。同时，Mfn2还参与调节了间质性膀胱炎的EMT过程，且表达上调[6]。EMT是上皮细胞通过特定的程序转化为具有间质表型细胞的生物学过程，也是白内障术后后发性白内障形成的重要原因。E-Cadherin是一种主要存在于表皮组织中的同亲型结合、钙依赖的细胞黏着糖蛋白，Vimentin是中间丝的其中一种蛋白质，上皮细胞发生EMT时的主要特征为细胞间黏附分子E-Cadherin表达减少、以细胞角蛋白细胞骨架转化为以Vimentin为主的细胞骨架及形态上具有间充质细胞的特征改变。研究表明，多种因素均参与了LECs发生EMT的过程，如结缔组织生长因子[7]、白细胞介素6等[8]细胞因子，miR-181a[9]、miR-26b[10]等非编码RNA及组蛋白去乙酰化酶(HDAC)[11-12]、缺氧诱导因子-1[13]、晚期糖基化终末产物AGE[14]等。

本研究发现，在TGF-β2的作用下，HLECs发生了EMT，将其作为后发性白内障的模型，与对照组相比，TGF-β2处理组中Mfn2 mRNA表达量明显升高，且蛋白表达增加，提示Mfn2参与了HLECs发生EMT的过程。pEGFP-Mfn2转染HLECs使Mfn2成功过表达后，与对照组相比，转染组上皮标志物E-Cadherin mRNA表达量下调，Vimentin mRNA表达量上调。E-Cadherin蛋白表达减少，Vimentin蛋白表达增加。进一步证明了Mfn2参与HLECs的EMT过程，而且过表达Mfn2会诱发HLECs发生EMT，但其具体作用机制有待进一步探究。

综上所述，Mfn2在后发性白内障的发病过程中起到了重要作用且表达上调，通过过表达Mfn2可诱发HLECs发生EMT，从而促进后发性白内障的形成。随着进一步深入研究，Mfn2有望作为后发性白内障生物治疗的新靶点，从新的角度为后发性白内障的预防和治疗提供思路。