电针干预对尾部悬吊小鼠比目鱼肌Foxo3a蛋白及mRNA表达的影响

季传婷，虎力，梁永瑛，温佩彤，徐平

(1.上海市徐汇区漕河泾街道社区卫生服务中心，上海 200235；2.上海中医药大学针灸推拿学院,上海 201203；3.上海市光华中西医结合医院，上海 200052)

失重条件下，人或动物的骨骼肌特别是抗重力肌会出现明显的萎缩，严重影响正常的功能活动。其发病机制复杂，肌肉发生的一系列变化特别是分子机制的变化目前还在不断探索中，Foxo3a(Forkhead Box O3a)属叉头转录因子的O亚型，是 Foxo亚家族的成员之一[1]。广泛表达于各种组织器官，如骨骼肌、心、脑、胰腺、肺、肝、肾、脾、小肠、外周血白细胞等[2-3]，有抑制细胞增殖的作用。鉴于电针在临床上对于多种原因导致的骨骼肌萎缩的有效性和本课题组前期研究发现，电针干预能够影响尾部悬吊小鼠形态学等改变[4]，因此本研究仍以电针为干预措施，对尾部悬吊小鼠比目鱼肌的Foxo3a进行检测，从而探讨Foxo3a在电针干预失重性骨骼肌萎缩中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物与分组

健康雄性C57小鼠，SPF清洁级，共28只，体质量18～22 g，购于斯莱克实验动物公司(上海)，动物合格证号：SCXK(沪)2007-0005，动物的饲养和实验在上海中医药大学实验动物中心进行。整个实验过程中对动物的各种处理均按照科技部2006年的关于动物的使用及伦理学规定进行。将动物随机分为正常组、尾吊组、提前电针组和电针组，每组7只。

1.1.2 主要仪器与试剂

Varifuge 3.0RS高速离心机(德国Heracus)；MK3酶标仪(芬兰Labsystems Multiskan)；PS-9电转仪(大连竞迈科技有限公司)；mini protean 3 cell电泳仪(BIO-RAD公司)； Foxo3a(美国CST公司)；cDNA合成试剂盒。

1.2 实验方法

1.2.1 模型的建立

用医用胶带固定距离动物尾尖部约2～3 cm处,固定处连接铁链，铁链悬吊于单笼顶部，调整铁链高度使小鼠前肢着地，并可自由活动，但不能够及垂直的四壁(单笼体积45 cm×40 cm×30 cm)而后肢悬空，身体的长轴与笼底平面呈30°～35°角(参照陈杰等[5]改良式大鼠尾部悬吊法建立)。

1.2.2 分组干预

正常组全程常规饲养；尾吊组前14 d常规饲养，后14 d尾部悬吊造模；提前电针组在尾吊组处理基础上于前14 d加用每天电针；电针组在尾吊组基础上于后14 d加入每天电针干预。电针每日1次，每次15 min。

电针方法：自制与水平面呈30°角的平台，固定小鼠于平台上，头部在下、下肢在上。参照《实验针灸学》[6]穴位定位，选取小鼠双侧“足三里”“阳陵泉”进行针刺。选用0.25 mm×25 mm启舟牌针灸针，直刺，进针深度约3～4 mm，接电针(SDZ-Ⅱ型苏州医疗用品厂电子针疗仪)，负极接 “足三里”穴，正极接同侧的“阳陵泉”穴，电流1 mA，连续波，频率为20～30 Hz，强度以小鼠的四肢轻微抖动为度。每日电针1次，每次为15 min，连续治疗14 d。

1.3 观察指标与检测方法

结束实验后，各组小鼠脱颈处死,快速取左侧比目鱼肌,立即置于-80 ℃液氮保存备用。

1.3.1 Western blot法检测Foxo3a

将液氮保存的比目鱼肌取出，加蛋白裂解液后碾磨,并用离心机离心,取上清后调至统一浓度，高温下变性4 min后用12%PAGE电泳；转至硝酸纤维膜上(半干转1 h 30 min)； PBS洗膜,滴加一抗(Foxo3a 1∶1 000；β-actin 1∶10 000)，4 ℃下2 h；加兔二抗，加入发光剂后曝光显影。结果应用Quantity One软件分析。设β-actin作为内参。

1.3.2 Foxo3a的Real-time PCR检测

取部分液氮保存比目鱼肌，提取总RNA，取1 μg RNA逆转录成cDNA；以SYBR Green作荧光染料，5 min 95℃预变性、15 s 95℃变性、60℃持续45 s退火及延伸，上述过程循环40次，将逆转录产物进行Foxo3a、β-actin PCR扩增。以β-actin为内参对照，以系统自带的ABI Prism 7500 SDS软件进行结果分析。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 各组小鼠Foxo3a蛋白表达

尾吊组与正常组比较Foxo3a蛋白的表达增加(P<0.05)；电针组与提前电针组及尾吊组相比Foxo3a蛋白表达减少(P<0.05)，但较正常组仍高(P<0.05)；电针组与提前电针组之间差异不明显。见图1、图2和表2。

注：1电针组；2尾吊组；3正常组；4提前电针组图1 各组小鼠Foxo3a蛋白表达条带

注：与正常组比较，*P#P图2 各组小鼠Foxo3a蛋白表达比较

表2 各组小鼠比目鱼肌Foxo3a蛋白表达比较

注：与正常组比较，*P<0.05；与尾吊组比较，#P<0.05。

2.2 各组小鼠Foxo3a mRNA表达

尾吊组与正常组Foxo3a mRNA比较明显增高(P<0.05)；，电针组和提前电针组与尾吊组相比Foxo3a mRNA明显降低(P<0.05)，但较正常组仍高(P<0.05)；电针组与提前电针组之间差异不明显。见图3、表3。

注：与正常组比较，*P#P图3 各组小鼠比目鱼肌Foxo3a mRNA表达比较

表3 各组小鼠比目鱼肌Foxo3a mRNA表达比较

注：与正常组比较，*P<0.05；与尾吊组比较，#P<0.05。

3 讨论

针灸在治疗多种骨骼肌萎缩中具有很好疗效，如李敏等针灸治疗经肌电图证实坐骨神经损伤性麻痹性肌萎缩等疗效显著，能有效延缓肌肉萎缩，促进神经再生等[7-9]，本研究在前人研究和本课题前期发现基础上，继续以电针对尾部悬吊的模拟失重小鼠模型进行了干预。

选穴方面，《黄帝内经》载“阳明者，五脏六腑之海，主润宗筋，宗筋主束骨而利关节也。冲脉者，经脉之海也，主渗灌溪谷，与阳明合于宗筋，阳明总宗筋之会，会于气街，而阳明之长，皆属于带脉而络于督脉，故阳明虚。则宗筋纵，带脉不引，故足痿不用也”。而足三里为足阳明胃经之合穴，“合治内腑”，因此笔者选穴足三里。阳陵泉为足少阳胆经之合穴，《难经》云：“筋病治此”,为八会穴之“筋会”，是治疗筋病的要穴。《马丹阳天星十二穴治杂病歌》中载：“阳陵居膝下，外廉一寸中，膝肿并麻木，冷痹及偏风……举足不能起，坐卧似衰翁，刺入六分止，神功妙不同。”因此笔者同时选用阳陵泉穴。

Foxo是转录因子家族成员，参与调节多种细胞进程，其中包括细胞周期、细胞凋亡、应激反应以及代谢等。在人类中有4个Foxo的同源基因，分别是Foxo1，Foxo2，Foxo3和Foxo4。其中Foxo3a在许多类型的细胞中有抑制细胞增殖的作用，可促进肌肉萎缩的表达[10-12]。通过Western blot和Real-time PCR检测显示，Foxo3a在4组小鼠中的蛋白和分子水平的表达一致。其中在正常组表达较低，而在尾吊组表达增高，Foxo3a在骨骼肌萎缩尾吊组较正常组的高表达，提示了Foxo3a在骨骼肌萎缩中的抑制细胞增殖、促进萎缩的作用和造模的成功；同步电针和预防电针治疗降低了Foxo3a的表达，说明电针干预能够降低Foxo3a的表达，电针发挥了对抗Foxo3a促细胞萎缩的作用。然而电针组和提前电针组的Foxo3a表达仍高于正常组，经电针治疗后Foxo3a的表达仍未降到正常组的水平，思考其原因:一是治疗14 d的治疗时间不够，有待于更长时间的治疗周期的进一步观察;二是可能电针并不能完全对抗Foxo3a，或有待于加入中药或其他治疗方法和手段或可发挥更好作用，这有待于在以后的工作中观察。电针组和提前电针组的Foxo3a表达未显示明显差异。提示两种不同切入干预时机的选择可能与对抗骨骼萎缩分子指标的影响不大，也可能与笔者选择的观察点只有14 d，观察点少和观察时间较短有关，这都有待增加观察点和延长观察时间进一步研究。另外骨骼肌萎缩中Foxo3a的上下游分子还有多种，也有待于笔者进一步的研究。

鉴于多种骨骼肌萎缩的相似临床表现和针灸干预的有效性，本研究对其他类型的肌萎缩可提供一定的借鉴，笔者也期望在未来工作中继续研究有所发现。