三七与黄连配伍时三七中3个有效成分溶出率变化规律研究

贾明璐，王静，田会东，陈雪平，王瑞*

(1.漯河市中心医院，河南 漯河 462000;2.漯河医学高等专科学校，河南 漯河 462000)

在临床上，将两味药一起应用往往能起到良好的协调或制约作用，这种在临床最习用的两味药就是药对，也称“对药”[1]。药对不是两味药的简单叠加，而是历代医药学家用药经验的科学提炼和智慧结晶，是中医用药的特色之一[2]。

三七是五加科植物三七的干燥根，常用于治疗冠心病、糖尿病、心绞痛等[3]；黄连是毛茛科植物黄连的干燥根茎，具有抗氧化、降压与降血糖的作用[4]。二者合用，具有清热燥湿、益气生津之功效，是治疗“消渴”的典型代表药对。研究表明，两种药材配伍后易产生相互作用，或产生助溶或产生沉淀，使有效成分溶出率发生变化，从而影响疗效[5]。活性成分溶出率随配伍比例变化规律是中药复方一个重要的研究内容[6-7]。然而，三七-黄连的最佳配伍比例尚无相关报道。因此，本试验设计了9个配伍比例(1∶0、4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、0∶1)参照《中华人民共和国药典》[8]质量要求，研究三七与黄连的配伍比例对三七中3个组分溶出率的影响，并从化学成分角度考察最佳配比，为三七-黄连药对的进一步开发应用提供理论依据。

1 仪器与材料

岛津LC-20A高效液相色谱仪(DGU-20A3R在线脱气系统、全波长色谱工作站、SPD-M20A光电二极管阵列紫外可见光检测器，日本岛津公司)；SIL-20AC自动进样器、CT0-20AC柱温箱(日本岛津公司)；16K台式高速离心机(珠海黑马医学仪器有限公司)；SB25-12D超声波清洗器(宁波新芝生物科技股份有限公司)；JY电子分析天平(上海衡平仪器仪表厂)；Milli-Q纯水仪(美国Millipore公司)。

三七皂苷R1对照品(批号:110745-201820，纯度93.1%，中国食品药品检定研究院)；人参皂苷Rb1对照品(批号:GSB-107939，纯度98.34%，斯坦福分析化学公司)、人参皂苷Rg1对照品(批号：GSB-705891，纯度99.87%,斯坦福分析化学公司)；三七和黄连均购自安徽瑞生源中药饮片有限公司，经本医院中药房田正印主任鉴定为五加科植物三七[Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen]的干燥根及根茎和毛茛科植物黄连(CoptischinensisFranch)的干燥根茎。

乙腈(色谱纯，Fisher)；甲醇(色谱纯，科密欧)；乙醇(分析纯，大茂)；水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5.0 μm )；流动相为乙腈(B)-水(A)，线性梯度洗脱(0～25 min，2%→20% B；25～50 min，20%→45% B；50～60 min，45%→70% B；60～65 min，70%B；65～70 min，70%→2% B)；流速:1.0 mL/min；柱温:35 ℃；检测波长:203 nm；进样量:20 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液制备

精密称取三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1适量，甲醇溶解定容于25 mL容量瓶中，摇匀，制成含三七皂苷R10.362 mg/mL,人参皂苷Rg11.350 mg/mL、人参皂苷Rb11.400 mg/mL的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液制备

分别按表1称取三七、黄连两味药材粗粉，置于500 mL圆底烧瓶中，加20倍量60%乙醇，加热回流2 h，称重，补足失重，摇匀，过滤，滤液置于离心管中，12 000 r/min离心10 min，取上清液，加水稀释1倍，摇匀，0.45 μm微孔滤膜过滤，即得，避光低温保存。

表1 各配伍比例药材称取量

2.3 HPLC检测色谱图

分别取上述溶液各20 μL，注入高效液相色谱仪，在“2.1”项色谱条件下测定，色谱图见图1。

2.4 线性考察

分别量取“2.2.1”项下混合对照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL，置于10 mL容量瓶中，甲醇定容，摇匀。精密吸取20 μL，注入高效液相色谱仪，在“2.1”项色谱条件下进样测定分析。以浓度(mg/mL)为X坐标，峰面积为Y坐标绘制标准曲线，建立回归方程。结果表明，三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1在各自浓度范围内均呈现良好的线性关系。如表2所示。

2.5 精密度试验

取“2.2.1”项下的混合对照品溶液，在“2.1”项色谱条件下连续进样6次，结果三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1峰面积的RSD分别为0.31%、0.57%、0.78%(n=6)，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验

取“2.2.2”项下三七与黄连之比为1:1供试品溶液，分别于0、4、8、12、24、48 h进样，三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1峰面积RSD值分别为1.93%、 1.05%、1.68%，表明供试品溶液在48 h内稳定。

注：1三七皂苷R1；2人参皂苷Rg1；3人参皂苷Rb1图1 混合对照品(A)、黄连阴性对照品(B)、三七阴性对照品(C)、样品(D)的HPLC色谱图

表2 3个成分的回归方程、r值及线性范围

2.7 重复性试验

按“2.2.2”项下方法平行制备三七与黄连之比为1∶1的供试品溶液6份，在“2.1”项色谱条件下检测。结果，三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1平均溶出率分别为1.14%、3.46%、1.12%，RSD分别为1.98%、1.31%、1.51%(n=6)，表明该方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验

平行量取1.0 mL含量已知的三七与黄连之比为1∶0供试品溶液，共9份，分别精密加入0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL“2.2.1”项下的混合对照品溶液制备加样供试品溶液(每个浓度3份)，按照“2.2.2”项的方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进行分析，测定三者的含量，计算回收率，结果平均回收率分别为 97.3%、99.7%、102.2%，RSD分别2.96%、0.92%、1.97%，符合加样回收规定。

2.9 数据处理与结果

2.9.1 有效成分溶出率

按三七-黄连药对9个不同比例精密称取药材，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，进样20 μL，计算不同配比条件下3种有效成分的溶出率，结果见图2～图4和表3。图2和图3显示，随着药对中黄连比例的提高，三七皂苷R1和人参皂苷Rg1的溶出率随之增加；当三七和黄连的比例为1∶2时，三七皂苷R1和人参皂苷Rg1的溶出率最高，但随着黄连比例的继续增加，二者的溶出率迅速降低；图4显示，随着药对中黄连比例的提高，人参皂苷Rb1的溶出率随之增加，当三七与黄连比例为2∶1时，人参皂苷Rb1的溶出率最高，随着黄连比例的继续增加，Rb1的溶出率随之降低。当药对比例为1∶3或1∶4时三者的溶出率都很低，均低于配伍前。

图2 三七皂苷R1溶出率

图3 人参皂苷Rg1溶出率

图4 人参皂苷Rb1溶出率

2.9.2 总溶出率考察

以药对中3个有效成分为考察指标，采用Hassan法进行“归一化法”数据处理[9]，求得各指标“归一值”，公式见(1)。其中Ymin为指标中最小值，Ymax为指标中最大值。

di=(Yi-Ymin)/(Ymax-Ymin)

(1)

然后，对各指标的“归一值”进行处理，得总评“归一值”(Overall desirability，OD)，其值越大越好，公式见(2)，其中k为指标数，结果见表3。由表4可知，当三七与黄连比例为2∶1时，最有利于3种有效成分的溶出，其次是3∶1，而比例为1∶4时，三者的溶出率最差。

OD=(d1×d2…×dk)1/k

(2)

表3 不同配伍比例下3个成分的溶出率(n=3)

表4 不同配比下3种成分的OD值

3 讨论

采用三七和黄连配伍辅助治疗2型糖尿病是我科经验方，临床应用已有多年，疗效确切，然而两种药材的最佳配比一直未从化学成分角度加以实验考察。皂苷类成分是三七中的主要活性成分，目前从三七中分离出鉴定出的达玛烷型皂苷多达70余个[10]，其中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1被《中华人民共和国药典》列为三七药材质控指标，因此，本研究选取这3个成分设置系列配伍梯度进行最佳配比的考察。据报道，三七中总皂苷的提取醇提优于水提，60%乙醇回流2 h提取最佳[11-12]。鉴于此，本研究在此条件下，设计了不同配比黄连三七中3个皂苷溶出率变化规律的考察实验。

实验结果表明，随着药对中黄连比例的增加，三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1的溶出率随之增加，在达到各自最大溶出率后随着黄连比例的继续增加，溶出率然而降低。当药对比例为1∶3或1∶4时三者的溶出率都很低，均低于配伍前。煎煮过程对中药复方临床应用和发挥药效有重要作用，不同药材在共同提取过程中化学成分之间可能发生助溶、挥发、水解、氧化、沉淀等复杂物理或化学作用，从而使某些化学成分的溶出增加、减少或消失，表现出不同的药理活性[13]。中医素有“不传之秘在于量”的说法，药量多少可影响其药力，配伍的不同可影响其药效[14]。三七的主要活性成分是皂苷类，黄连的活性成分主要是生物碱类，皂苷是一种很好的表面活性剂，往往对其他物质有助溶现象。这就提示三七对黄连中化学成分的溶出可能也有重要影响，在后续的实验研究中将继续探讨。

据研究报道[15]，当实验考察指标超过1个时，指标之间往往互相影响，对其中一项指标有利的方案可能不利于其他指标，最终确定的方案要依据所有指标的综合效应。为了使3个考察指标之间具有加和性，笔者采用Hassan法进行“归一化法”数据处理，然后对各指标的“归一值”求几何平均数得总评“归一值”(Overall desirability，OD)，以OD值表达最终效应，从而将3个考察指标综合起来。通过计算不同配伍比例条件下3种成分溶出率的总评归一值，发现当三七与黄连配伍比例为2∶1时，三者的总溶出率最大，1∶4配比时，最不利于3个有效成分的溶出。三七-黄连配伍比例为2∶1较合理。

本研究通过比较黄连-三七药对不同配伍比例三七中3个有效成分溶出率的变化，可以为黄连-三七药对配伍化学本质的揭示提供依据，在下一步的研究中，将从药效学视角[16-17]进一步考察，从而为临床黄连-三七药对的使用提供参考依据。