黄酮类复配保鲜剂对香蕉采后品质的影响

曾俊，杨嘉利，杨宝，朱虹*

（1.中国科学院华南植物园，广州510650；2.中国科学院大学，北京100049）

作为热带水果的代表，香蕉采后具有后熟的特性，一旦转黄变软后，货架期就大大缩短，且极易腐烂，严重损害其食用品质和经济价值。因此，延缓香蕉成熟，提高香蕉采后品质对实现其经济价值非常重要。目前，商业上有关香蕉采后贮运较为有效的保鲜方法一是控制其内源激素乙烯的释放，二是通过采后浸泡化学防腐剂来达到抑菌抗病的目的。人们对食品安全的重视程度变得越来越高，开发安全无毒的植物源保鲜防腐剂日益重要。

黄酮类化合物是一类植物次生代谢产物，广泛存在于自然界中，是以黄酮为母核而衍生出的黄酮同分异构体及其氢化和还原产物[1-2]。黄酮类化合物在植物界分布很广，在植物体内大部分与糖结合，以苷类或碳糖基的形式存在，少量呈现为游离态[3]。研究表明，黄酮类化合物有提高动物机体抗氧化及清除自由基的能力，其原理是酚羟基上的氢原子可与超氧自由基结合生成黄酮自由基，进而与其他自由基反应，从而终止自由基链式反应[4]。大多数黄酮在植物胁迫应激下大量积累，对微生物产生程度不等的抑菌活性[5]。此外，黄酮类化合物还具有雌激素的双重调节作用，能影响动物体内激素的水平[6]。桑色素（morin）和木犀草素（luteolin）是植物中常见的多羟基黄酮化合物，具有良好的抗氧化性，可保护细胞免受过氧化氢的损伤[7-9]。此外，这2 种黄酮还具有良好的抑菌作用：木犀草素对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和多种病毒有良好的抑制效果[8]，而桑色素可有效抑制变形链球菌等多种病原菌的生长[10]。桑色素和木犀草素因其具有抗炎、抗癌、抗过敏等多种药理活性[7,11-12]，被广泛运用在保健品、药品等领域，但这2种物质在果蔬采后保鲜领域的应用还比较少。笔者的前期研究发现，桑色素可作为良好的保鲜剂，有效延缓香蕉后熟与衰老[13-14]。本文旨在研究桑色素-木犀草素的复配联用对香蕉的保鲜作用。通过测定轴腐病病情指数，评估复配对香蕉的抑菌作用；通过测定色度、硬度、呼吸速率、乙烯释放速率等参数，明确桑色素-木犀草素复配对香蕉后熟的调节作用。此外，利用核磁共振（nuclear magnetic resonance,NMR）波谱分析鉴定不同成熟阶段香蕉果皮的代谢物图谱，并通过主成分分析（principal component analysis,PCA）表征复配延缓香蕉成熟衰老的主要代谢物，从更深层面了解其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 试验材料及处理

香蕉（Musa acuminata,AAA group,cv.‘Brazil’）果实于2019年4月1日采自广东省广州市南沙区万顷沙蕉园，采收时果实饱满度为70%～80%，采收后立即运回实验室。落梳后，分为单个蕉把，每个蕉把平均4～5 个单果；挑选大小均匀、无病虫害及无机械伤的蕉把，用清水清洗，去除顶部残余的花器。取成熟度相对一致的蕉把随机分成2 组：第1 组成把放入2 L 清水中浸泡5 min，作为对照组（CK）；第2 组先将0.25 g 桑色素均匀溶解于50 mL 0.01%NaOH 溶液中，再加入0.5 g 木犀草素，充分溶解后加入清水并定容至2 L，配成2种有效成分终质量分数分别为0.012 5%和0.025%的保鲜剂，随后成把放入上述保鲜剂中浸泡5 min，作为处理组（桑色素-木犀草素）。处理的关键点是成把充分浸泡蕉梳新鲜切口部分，之后捞出自然晾干，约5 h后向下弯曲装入到聚乙烯薄膜袋中，放入筐内，置于22 ℃、湿度为80%～90%的环境中贮藏。每个处理重复3 次。根据贮藏期间果实的外观变化，在0、10、17 和26 d时取样，统计病情指数，测定生理指标和冻存样品的代谢物指标。

1.2 测定方法

1.2.1 轴腐病病情指数测定

参照秦碧霞等[15]的方法，轴腐病的分级标准：0级，轴处无病；1级，轴切口处有病或1/5面积以内发病；2级，轴切口处＞1/5～2/5范围内发病；3级，轴切口处＞2/5～3/5范围内发病；4级，轴切口处3/5范围以上发病或病害危及果轴深处。病情指数（disease index,DI）分级标准计算公式为：

式中：n为每个发病级数的蕉把数；r为发病级数，且r≤4；N为检查的蕉把总数。

1.2.2 果皮色度测定

采用日产柯尼卡美能达色彩色差计CR-400测定果皮颜色。随机挑选3 个果实，在果实的头、中、尾部分别测定3 个点，每个点重复测定3 次。测定条件：C/2 光源，测色光斑直径为10 mm，以白板为标准样；标准白板在C/2光源下X（红色）、Y（绿色）、Z（蓝色）的值分别为92.78、94.64和108.27。测定L、C、a、b、h°值，以表示果实颜色，其中：L值表示亮度，范围从0（黑）～100（白）；C值表示色饱和度；a的正值表示色泽红/紫，负值表示浅蓝/绿；b 的正值表示黄，负值表示蓝；色度角h°=180°+tan－1(b/a)。

1.2.3 果实硬度测定

利用GY-4型果实硬度计测定果实的硬度。随机挑选3 个果实，测定时在表皮削去约1 mm，在果实头、中、尾部分别测定3 个点，每个点重复测定3次。所用的硬度计针头为圆筒形，直径为4 mm，硬度单位为牛顿（N）。

1.2.4 果实呼吸速率测定

参照刘亭等[16]的方法测定果实呼吸速率。试验材料为颜色、大小、成熟度相对一致的蕉把，称量后密封于塑料盒内，然后将2 个通气口分别插入便携式LI-6262型CO2/H2O分析仪（LI-COR公司，美国）的2 个接口，打开气体循环泵，记录5 min 内每隔1 min 仪器数字显示的CO2浓度值，平行测定3 次。呼吸速率计算公式：

式中：C1表示t1时刻密闭容器中CO2浓度，μmol/mol；C2表示t2时刻密闭容器中CO2浓度，μmol/mol；V表示密闭容器的容积，L；M表示CO2的摩尔质量，g/mol；V0表示测定温度下CO2摩尔体积，L/mol；m表示测定用果实的质量，kg；t表示记录CO2浓度的时间点，min。

1.2.5 果实乙烯释放速率测定

采用气相色谱-氢火焰离子化检测器（gas chromatography-flame ionization detection,GC-FID）测定果实乙烯释放速率[17]。在室温下，挑选颜色、大小、成熟度相对一致的蕉把，称量后密封于塑料盒内，放置2 h。用排水集气法将气体收集到西林瓶中，用封口膜封好并倒立存放。取样品气体1 mL注入GC-7890A 气相色谱仪（安捷伦公司，美国）中检测乙烯含量，采用峰面积对进样量作乙烯标准曲线，重复操作3次。乙烯释放速率计算公式：

式中：C 表示从标准曲线上查得的乙烯体积分数，μL/L；V表示密闭容器的容积，L；m表示测定用果实的质量，kg；t表示密封时间，h。

1.2.6 果皮NMR 鉴定

将贮藏0、17和26 d的香蕉果皮样品用于NMR鉴定。取1 g液氮冷冻的果皮，研磨至粉末状态，转移250 mg 至离心管中，加入1 mL 氘代甲醇（含0.03%四甲基硅烷），密封离心管，40 ℃超声辅助提取30 min。以1.2×104g 离心10 min，转移上清液至ST500-7 核磁管（Norell 公司，美国）中，扫描1HNMR谱，每个样品重复扫描3次。贮藏0、17和26 d的香蕉处理组分别命名为：T-0-1、T-0-2、T-0-3；T-17-1、T-17-2、T-17-3；T-26-1、T-26-2、T-26-3。贮藏0、17 和26 d 的香蕉对照组分别命名为：C-0-1、C-0-2、C-0-3；C-17-1、C-17-2、C-17-3；C-26-1、C-26-2、C-26-3。

1.3 数据统计与分析

使用Excel 2016进行数据统计，SPSS 25.0软件进行方差分析。利用SigmaPlot 12.5 软件绘图，SIMCA 15.0软件进行主成分分析。

2 结果与分析

2.1 桑色素-木犀草素复配处理对香蕉轴腐病的影响

香蕉轴腐病（又称“冠腐病”）是一种在贮运期常见的真菌性病害，往往伴随着香蕉的后熟进程而发生，主要引起蕉指脱落、果轴腐烂，严重影响香蕉的果实品质和商品价值。表1统计了贮藏期间香蕉轴腐病的病情指数，并比较了处理组（桑色素-木犀草素）与对照组（清水）的发病程度。贮藏第10 天时，在对照组和处理组香蕉上均观察到轴腐病的发生，具体表现为蕉梳切口处出现少量白色絮状霉层。贮藏第17 天时，病部继续向果轴部延伸，颜色渐渐变为深褐色并出现水渍状斑块。贮藏第26 天时，果轴部腐烂严重，部分出现蕉指脱落现象。然而，在贮藏期内处理组香蕉轴腐病的病情指数始终低于对照组，尤其在第17天时差异达到了显著水平（P＜0.05）。而在贮藏后期，对照组和处理组轴腐病病情指数差异不明显，说明桑色素-木犀草素复配处理可有效控制贮藏前期的香蕉轴腐病的发展，特别是在第17天时达到显著水平。

2.2 桑色素-木犀草素复配处理对香蕉果皮色泽和硬度的影响

色泽可用色度角（h°值）度量，是衡量香蕉果实成熟与衰老的重要指标之一。随着贮藏期的延长，香蕉由青绿色转为黄色，h°值会逐渐降低。由图1A可知：对照组香蕉在第17 天时开始转黄，h°值显著降低，而处理组几乎没有变化；贮藏第26 天时处理组香蕉的h°值显著降低，接近于对照组，表明桑色素-木犀草素复配处理显著延迟了果实的转黄。而对照组h°值继续下降，推测是由于贮藏后期果皮褐变所致。总体而言，桑色素-木犀草素复配处理有效地延缓了香蕉果实色泽的转变。

表1 桑色素-木犀草素复配处理对贮藏期香蕉轴腐病的影响Table 1 Effect of morin-luteolin treatment on controlling crown rot of banana during storage

硬度是判断香蕉果实后熟度的重要依据之一。在采后贮藏过程中，香蕉硬度降低，果实逐渐软化。由图1B 可知：在贮藏的前17 d 内，处理组香蕉硬度没有出现明显变化，而对照组香蕉硬度显著下降；在贮藏第26天时，对照组香蕉果实硬度下降更为明显，果皮褐变并伴随炭疽病发生，而处理组则刚转为全黄，硬度仍显著高于对照组，说明桑色素-木犀草素复配处理有效地延缓了香蕉果实软化，并且维持了转黄后的果实硬度。

2.3 桑色素-木犀草素复配处理对香蕉果实呼吸速率和乙烯释放速率的影响

作为典型的呼吸跃变型果实，乙烯峰和呼吸高峰的出现标志着香蕉后熟过程的启动，是其重要的生理转折点。图2A 和2B 显示：对照组香蕉果实的呼吸高峰和乙烯峰均出现在第17天左右，而后均快速下降。桑色素-木犀草素复配处理组显著地推迟了呼吸高峰和乙烯峰的出现，但对峰值的影响并不大。伴随着呼吸跃变，香蕉果实发生一系列明显的生理生化变化，包括果实变软及果皮退绿变黄，同时抗病性减弱，导致病害显现。在采后贮藏过程中，对照组和处理组的香蕉果实呼吸高峰和乙烯峰的出现与其色泽、硬度的变化趋势均呈现显著的相关性，即随着果实呼吸增强和乙烯峰的出现，果实呈现出明显的转色和软化现象。桑色素-木犀草素复配处理显著延缓了香蕉果实采后呼吸峰的出现，延缓了其色泽和硬度的变化，并降低了病情指数。综上表明，0.012 5%桑色素和0.025%木犀草素结合的复配保鲜剂可以有效地延缓香蕉后熟进程和控制轴腐病发生。

图1 桑色素-木犀草素复配处理对贮藏期香蕉果皮色泽和果实硬度的影响Fig.1 Effect of morin-luteolin treatment on the color of peel and firmness of banana fruit during storage

图2 桑色素-木犀草素复配处理对贮藏期香蕉果实呼吸速率和乙烯释放速率的影响Fig.2 Effect of morin-luteolin treatment on the respiratory rate and ethylene release rate of banana fruit during storage

2.4 香蕉果皮提取物成分的NMR 鉴定分析

香蕉的成熟软化过程伴随着代谢物成分的变化。NMR是定性定量分析复杂代谢物的有效手段。本研究选择了3 个具有显著生理差异的贮藏期（0、17、26 d）的香蕉果皮样品进行了一维NMR鉴定，并分析了桑色素-木犀草素复配处理对香蕉代谢物成分的影响。所鉴定的13 种代谢物及其化学位移归属见表2。可以看出，所鉴定的代谢物主要为直接参与植物生长发育的初生代谢物，包括乳果糖碳水化合物、β-葡萄糖、α-葡萄糖、蔗糖等，自由氨基酸如丙氨酸、谷氨酰胺、L-天冬氨酸等，酚类物质去甲猪毛菜碱及小分子有机物如乙醇、乙酸、苹果酸、胆碱和磷酸胆碱等。这些代谢物在不同贮藏期的组成及含量存在显著差异，且受到桑色素-木犀草素复配处理的影响。

表2 1H-NMR质谱图质子信号的归属Table 2 Assignment of proton signals in 1H-NMR mass spectra

13 种代谢物在1H-NMR 质谱图的特征质子信号见图3。在1H-NMR 质谱图中，化学位移在3.0～5.5之间的重叠质子信号可归属为碳水化合物，化学位移为4.10（d,J=8.3 Hz）的可归属为果糖的信号，4.47（d,J=7.8 Hz）的归属为β-葡萄糖，5.11（d,J=3.6 Hz）、5.39（d,J=3.8 Hz）分别为α-葡萄糖和蔗糖[18-19]。自由氨基酸的鉴定与我们之前的工作[14,19]类似。位于1.46的双重峰、3.64的多重峰可归属为丙氨酸，位于2.12、2.47、3.66 的多重峰归属为谷氨酰胺，位于2.57、2.80、3.78的多重峰归属为L-天冬氨酸。化学位移在6.5～8.0 的质子信号可归属为酚类物质[20]。仅在26 d贮藏期的香蕉样品中出现2个芳香质子信号（6.58、6.64），归属为去甲猪毛菜碱。其他小分子有机物也被鉴定出来。位于1.18（t,J=7.0 Hz），3.62的信号来自乙醇，位于2.45、2.75、4.27 的多重峰信号来自苹果酸，1.91的单峰信号是乙酸，3.17的信号是胆碱，3.23的信号是磷酸胆碱。

图3 香蕉果皮提取物的1H-NMR质谱图Fig.3 1H-NMR mass spectra of banana peel extracts

对照组与桑色素-木犀草素复配处理组在不同贮藏期的1H-NMR质谱图比较见图4。随着香蕉的成熟衰老，其果皮中小分子代谢物的组成与含量均发生了显著变化，而桑色素-木犀草素复配处理可有效延缓此变化的进程。

2.5 香蕉果皮提取物成分的主成分分析

香蕉果皮提取物的代谢物成分是根据NMR质谱图的特征峰进行定性分析所得的，而其定量则是根据其对应峰面积而进行计算的。本研究采用主成分分析（PCA）表征桑色素-木犀草素复配处理对成熟过程中香蕉果皮提取物变化的影响。如图5A所示，前2个主成分解释了87.1%的总变量，其中第1主成分可解释67.2%。上述数据表明，此模型有良好的解释能力和预测能力。

PCA 得分图可用于分析所有样品的数据相似度。如图5B 所示，3 个重复样品紧密聚集，表明此试验有良好的重复性。对照组贮藏0 d、桑色素-木犀草素复配处理组贮藏0 d 及桑色素-木犀草素复配处理组贮藏17 d聚在一起，位于第2象限；对照组贮藏17 d、桑色素-木犀草素复配处理组贮藏26 d聚在第4 象限；而对照组贮藏26 d 自成一簇，位于第1象限。结果表明，在香蕉的成熟过程中，其果皮代谢物图谱有显著变化。贮藏17 d的桑色素-木犀草素复配处理组与贮藏0 d 的对照组、贮藏26 d 的桑色素-木犀草素复配处理组与贮藏17 d的对照组的代谢物图谱相似，表明桑色素-木犀草素复配处理可延缓香蕉代谢物图谱的变化。

PCA 载荷图可用于解释香蕉成熟衰老过程中桑色素-木犀草素复配处理组与对照组主要成分的差异。如图5C 所示，第1 主成分主要为磷酸胆碱、果糖、丙氨酸、L-天冬氨酸、乙酸、苹果酸、谷氨酰胺、β-葡萄糖、α-葡萄糖、乙醇、去甲猪毛菜碱；第2主成分主要为胆碱和蔗糖。

在贮藏过程中，主成分蔗糖含量急剧上升，对照组在贮藏第17 天时达到峰值，而桑色素-木犀草素复配处理组在整个贮藏阶段持续缓慢上升。果糖是蔗糖的代谢产物，其变化趋势与蔗糖一致。在贮藏前期，几乎检测不到β-葡萄糖、α-葡萄糖；在贮藏17 d后，在对照组才被检测出来；随后大量累积。而桑色素-木犀草素复配处理组直至贮藏第26天时才检测出β-葡萄糖、α-葡萄糖。氨基酸是香蕉的重要营养成分，其代谢在采后过程中发生显著变化。丙氨酸、L-天冬氨酸及谷氨酰胺是引起代谢变化的主要氨基酸，在贮藏过程中均呈现显著上升趋势。桑色素-木犀草素复配处理组与对照组相比，复配处理组的上升速率明显较低。处理组贮藏26 d 时的氨基酸累积与对照组贮藏17 d 时的累积相当。去甲猪毛菜碱仅出现在贮藏后期（第26 天）且含量极低，其中复配处理组显著低于对照组。

图4 不同贮藏阶段的香蕉果皮提取物1H-NMR质谱图Fig.4 1H-NMR mass spectra of banana peel extracts from three storage stages

图5 香蕉果皮提取物的代谢物主成分分析结果Fig.5 PCA results for the metabolite profile of banana peel extracts

3 讨论

作为2 种常见的黄酮多羟基衍生物，桑色素和木犀草素的抗氧化性和抑菌作用已被广泛报道[7-10]。目前，黄酮类化合物在果蔬采后保鲜领域的应用还比较少。在前期开展的多种黄酮类化合物保鲜剂的单因素浓度梯度试验中，发现保鲜剂单体处理均有一定保鲜效果，比如桑色素的作用主要体现在延缓果实成熟上，而木犀草素对于病菌的抑制作用最为显著（数据未发表）。另外，笔者的前期研究发现，一些保鲜剂单体经过一定比例的复配后能够产生协同增益效果。考虑到延缓成熟和抑制发病这2个因素，本研究最终选择使用桑色素和木犀草素这2 种黄酮类化合物的复配进行香蕉保鲜处理，而文中报道的复配比例正是基于前期试验的优化方案。

本试验结果表明：复配处理后对香蕉果皮的转色，果实的硬度、乙烯释放速率、呼吸速率和发病率等均产生了显著的影响。果实采收后仍然是具有一定代谢活动的生命体，各个生理指标之间存在着紧密的联系，而乙烯被认为是控制果实成熟衰老和抗病性的关键激素。桑色素和木犀草素复配保鲜剂显著地延缓了采后香蕉果实乙烯峰和呼吸跃变峰值的出现，应该是早期抑制果实病情指数快速上升的主要原因。此外，桑色素和木犀草素作为黄酮类化合物被报道是良好的抗氧化剂，因此，复配处理同时也通过降低果实的代谢水平来增强果实自身的抗氧化能力。

碳水化合物是香蕉的主要成分，其代谢与香蕉果实采后成熟的品质密切相关。碳水化合物的组成与含量直接影响香蕉的甜味及质构。淀粉是绿皮香蕉的主要碳水化合物，随着呼吸峰的出现，其含量急剧下降，并伴随蔗糖、果糖等水解产物的累积[21]。桑色素-木犀草素复配处理有效延缓呼吸峰的出现，从而延缓淀粉向蔗糖及其他单糖的转化。此外，桑色素-木犀草素复配处理有效延缓了氨基酸代谢变化，从而延缓了香蕉的成熟衰老。去甲猪毛菜碱是香蕉果皮的酚类成分，具有去极化多巴胺神经元的作用，与帕金森病的发生密切相关[22]。香蕉中的去甲猪毛菜碱可能是多巴胺与乙醛的Pictet-Spengler 聚合产物，其出现往往伴随着多巴胺的降解[14,19,23]。NMR 分析并未鉴定出多巴胺，可能是其丰度过低未达到检测限而引起的。桑色素-木犀草素复配处理有效延缓了去甲猪毛菜碱的积累，从而延缓香蕉的衰老。乙醇、乙酸、苹果酸、胆碱、磷酸胆碱是香蕉常见的代谢物，属于PCA 载荷图的前2个主成分，可能与香蕉成熟衰老过程中碳水化合物代谢、蛋白质代谢和脂质代谢相关。

前期的浓度梯度筛选试验还表明，在一定范围内增加处理浓度，可增强保鲜效果。但浓度过大，投入成本会显著增加，不利于保鲜剂的推广使用。因此，综合考虑保鲜效果和成本，本试验最终选择桑色素和木犀草素的复配质量分数分别为0.012 5%和0.025%。另外，复配处理仅对蕉梳的新鲜切口部位进行了浸泡，但是整果浸泡能否加强果实对炭疽病的防控效果，值得进一步探究。

4 结论

桑色素-木犀草素复配保鲜剂可以有效地延缓采后香蕉果实呼吸跃变峰值的出现，推迟果皮退绿变黄及果实变软，抑制轴腐病的发生。通过NMR分析，从香蕉果皮中鉴定出了13种代谢产物。PCA分析结果表明，桑色素-木犀草素复配处理可有效抑制香蕉果皮代谢物的变化，延缓蔗糖、果糖、葡萄糖的累积，延后丙氨酸、L-天冬氨酸和谷氨酰胺的累积。因此，桑色素-木犀草素作为复配保鲜剂，能有效保持香蕉采后品质。在实际生产应用中，可适当延长处理时间，以获得更为理想的保鲜效果。