定量蛋白质组学在果蔬采后商品化处理中的研究现状及进展

梁泽，王蕾，杨明依，罗自生,2,3，徐艳群,3，李莉,2,3*

（1.浙江大学生物系统工程与食品科学学院，杭州310058；2.浙江大学，农业农村部农产品产后处理重点实验室，杭州310058；3.浙江大学宁波研究院，浙江 宁波315100）

21世纪以来，在经济快速发展和人民生活水平不断提高的大背景下，我国果蔬的产量和贸易成交量都有了显著的增长，但由于果蔬的生产具有较强的季节性，所以人们对果蔬采后品质保持和精准调控的需求不断提高。据商业部统计，果蔬采后商品化处理、贮藏和运输存在技术水平低、贮运设施不足等问题，导致果蔬采后损耗率高达20%～30%，每年果蔬损失高达800万t，经济损失达800亿元[1]。

果蔬采后商品化处理涉及果蔬采后成熟衰老过程的复杂调控，如叶绿素和淀粉的降解[2-3]、色素和挥发性化合物的生物合成[4]、糖和有机酸的积累[5]等生理和生化变化。这些变化不仅受到果蔬自身基因表达的调控，而且受到采后保鲜、贮藏、运输条件等商品化处理的影响。国内外学者对果蔬成熟衰老的生理生化调控进行了大量研究，但是鉴于研究成本及方法等的限制，蛋白质组表达和调控的分子机制研究还处于起步阶段。此外，果蔬在成熟衰老过程中存在蛋白质翻译后修饰过程，参与许多果蔬商品化处理进程中酶或调节蛋白的调控。因此，基于定量蛋白质组学研究果蔬采后商品化处理以调控果蔬品质的转录后水平和生理生化反应，是一种科学可靠的新途径。

现阶段，生命科学研究正式迈向了后基因组时代，蛋白质组学研究成为生命科学研究的核心手段[6]。蛋白质组学主要是研究生命有机体中蛋白质的种类和形式以及它们相互作用、蛋白定位和修饰等方面的内容，它描述了在特定条件下、特定时间内生物体、细胞、组织或细胞中蛋白质表达的全面鉴定和定量分析[7]。蛋白质组学可以根据目标的不同分为描述性蛋白质组学、比较蛋白质组学、翻译后修饰、相互作用等[8]。蛋白质组学在过去常被用于生物医学的研究，目前也被广泛应用于动物医学[9]、食品科学[10]、环境毒理学[11]等的研究。蛋白质组学的主要优点之一是高通量，现代蛋白质组学技术能够在给定的生物样本中识别上万种的蛋白质[12]。利用定量蛋白质组学技术研究果蔬采后商品化处理各进程的调控机制具有重要意义，这可以为研究果蔬采后品质的分子调控机制提供“宏观”指导和帮助。

1 利用蛋白质组学研究果蔬采后商品化处理的生理病理变化

1.1 蛋白质组学在果蔬采后成熟衰老过程中的研究应用

果蔬采后成熟衰老过程涉及多种生理和化学变化，对果实品质和产品货架期有着重要的影响[13]。果实的成熟衰老过程涉及叶绿素、淀粉的降解，有机酸、色素等物质的合成以及颜色和香气的变化[14]等。果蔬的成熟过程因品种不同而出现差异，可以分为呼吸跃变型果蔬（如苹果、梨、桃和香蕉等）和非呼吸跃变型果蔬（如柑橘类、樱桃和草莓等）。呼吸跃变型果蔬在成熟过程中伴随乙烯释放速率和呼吸强度峰值的出现，而在非呼吸跃变型果蔬成熟过程中则无此变化[7]。因此，了解果实成熟的调节机制有利于改善保鲜处理技术，提高果实品质，减少采后商品化处理损失。近年来，关于果蔬采后定量蛋白质组学的研究如表1所示。

1.1.1 蛋白质组学在呼吸跃变型果蔬中的应用

苹果是一种常见的呼吸跃变型果实，其品质和生理生化指标在呼吸跃变前后会有显著的变化，因此在采收期间必须适时采收[15]。ZHENG 等[16]采用双向电泳（two-dimensional gel electrophoresis,2-DE）技术与SYPRO Ruby（一种具有改进灵敏度和定量准确度的荧光染色法）联用的定量蛋白质组学技术，发现苹果果实成熟与许多蛋白质的丰度增加有关，这些蛋白质具有参与乙烯合成、抗氧化系统运行、碳水化合物代谢等功能。ZHOU 等[17]结合气相色谱-质谱联用仪（gas chromatography-mass spectrometer,GC-MS）和同位素标记定量（isobaric tag for relative and absolute quantitation,iTRAQ）技术，研究桃果皮在成熟过程中芳香化合物和蛋白质谱的变化，证明脂肪酸代谢是桃果实中芳香族化合物形成的主要途径，丙二烯氧化物环化酶（allene oxide cyclase,AOC）、丙二烯氧化物合成酶（allene oxide synthase,AOS）、脂氧合酶（lipoxygenase,LOX）和12-氧-植物二烯酸还原酶（12-oxo-phytodienoic acid reductase,OPR）是内酯合成的关键功能蛋白，与蜜桃的特征香气形成密切相关。XIAO 等[18]利用iTRAQ 技术对香蕉果实细胞壁蛋白质组进行了分析，发现了162种差异表达的分泌蛋白，这些蛋白主要参与细胞壁代谢、应激反应和防御、信号传导及蛋白质代谢和修饰，这有助于保持香蕉采后感官质量并减少采后果实损失。REUSCHER 等[19]利用非标记蛋白质丰度指数（exponentially modified protein abundance index,emPAI）技术对梨果实进行蛋白质鉴定和果肉组织定量分析，解析了梨采后阶段相关的生物学过程，有利于梨果品种培育和优化。WU等[20]采用2-DE 和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption ionization-timeof flight mass spectrometry,MALDI-TOF/MS）方法鉴定出桃线粒体蛋白质组大多与能量代谢和氧化应激有关，此外，一些抗氧化酶如锰超氧化物歧化酶（superoxide dismutase[Mn],Mn-SOD）、磷脂过氧化氢谷胱甘肽过氧化物酶（phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase,PHGPx）、过氧化氢酶（catalase,CAT）和醌氧化还原酶家族在活性氧（reactive oxygen species,ROS）清除方面表现突出，可以通过改变线粒体蛋白表达和减轻线粒体损伤来调节果实衰老。

表1 果蔬采后定量蛋白质组学代表性研究（2010年至今）Table 1 Representative studies on quantitative proteomics of postharvest fruits and vegetables(since 2010)

1.1.2 蛋白质组学在非呼吸跃变型果蔬中的应用

目前，关于非呼吸跃变型果蔬的研究主要集中于草莓、葡萄和柑橘等[50]。LI 等[51]通过对草莓非标记定量蛋白质组学的研究（图1），证实草莓贮藏后蛋白质组表达谱与典型延迟衰老进程密切相关，这些蛋白质涵盖一系列功能代谢途径和网络，涉及能量代谢、碳水化合物和挥发性生物合成等；LI等[45]还通过肽二甲基化的稳定同位素标记对成熟期间草莓果实进行了定量蛋白质组学研究，在草莓果实中鉴定到800 余种蛋白质，它们在草莓成熟期间参与类黄酮和花色苷生物合成、挥发性成分生物合成、抗氧化还原代谢、应激反应和过敏原形成的蛋白质表达量上调，并且参与蛋氨酸代谢、能量代谢和蛋白质合成的相关蛋白质表达量下调。MA等[39]对柑橘采后进行2，4-二氯苯氧基乙酸（2,4-dichlorophenoxyacetic acid,2,4-D）处理，通过高效液相色谱-串联质谱法（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,HPLCMS/MS）检测发现，柑橘激素水平显著增加，利用GC-MS 检测出乙烯合成量降低，证实2，4-D 可以改变许多内源激素的水平和上调防御相关基因、蛋白质来改善胁迫防御能力，从而延缓果实衰老。

图1 果蔬采后定量蛋白质组学研究策略图Fig.1 Quantitative proteomic strategies of postharvest fruits and vegetables

1.2 蛋白质组学在果蔬采后抗病性研究中的应用

在果蔬采后商品化处理过程中，随着采后成熟和衰老，新鲜果蔬的抗病性逐渐降低，更容易遭受丝状真菌的侵染而腐烂[52]。梨在世界范围内广泛种植，而由于病原体感染引起的病害会导致梨产量的大量损失。YAN等[30]利用2-DE、MALDI-TOF技术研究解析了季也蒙毕赤酵母（Meyerozyma guilliermondii）对导致梨果实腐烂显著的蓝霉菌的生物学控制，发现梨果实抗氧化酶活性得到改善，苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonialyase,PAL）活性也显著增强，这些结果为梨果实的生物防治机制提供了新的见解。葡萄在采后商品化处理过程中易受到青霉菌的感染。LORENZINI 等[48]通过MS/MS 分析鉴定受到青霉菌侵染的葡萄内蛋白质得出，相关青霉菌株侵染对葡萄内蛋白质表达调控具有重要影响，能够诱导发病相关蛋白质和参与能量代谢的其他蛋白质表达量的积累；由青霉菌感染鉴定出的蛋白质，可用作真菌感染的特异性标志物，通过蛋白质组学检测发现，青霉菌可以抑制真菌的生长。苹果采后受到非生物胁迫和生物胁迫，在全球范围内蒙受巨大经济损失。BURONMOLES 等[53]采用基于荧光Bodipy 的蛋白质羰基检测方法，检测并鉴定了苹果采后27 种氧化蛋白，并将其作为敏感的ROS靶点，发现这些ROS靶蛋白与代谢过程有关，表明该过程在苹果果实对非生物胁迫的防御反应中起主导作用。总之，利用蛋白质组学可以更好理解受损的蛋白质功能如何影响果实的“免疫系统”。

1.3 蛋白质组学在果蔬采后致敏性研究中的应用

果蔬是我国十大过敏食物之一，果蔬过敏症状包括轻度的口腔过敏综合征和表现在多种器官的全身系统性反应。果蔬中的过敏蛋白是引起过敏反应的原因，主要为抑制蛋白和一些酶类。SHAHEEN 等[54]运用液相色谱-串联质谱（liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS）技术对扁豆品种中的过敏原和推定的过敏蛋白进行深度测序和定量，鉴定了180 余种扁豆中蛋白肽，并通过多反应监测（multiple reaction monitoring,MRM）分析验证了一些小扁豆过敏原蛋白，为进一步进行靶向定量分析提供了理想的扁豆肽过敏原。CARDONA 等[55]利用组合肽配体库技术（combinatorial peptide ligand library,CPLL）提取杧果蛋白质组，并通过蛋白质印迹分析二维图鉴定被称为过敏原的果胶酯酶和超氧化物歧化酶，进一步加深了人们对果蔬过敏研究的认识。

2 利用蛋白质组学研究采后商品化处理调控果蔬品质的分子机制

近年来，国内外学者针对果蔬采后保鲜贮藏过程进行了大量研究，如激素调节[56]、温度控制[4]、气体浓度[57]等能够有效延缓果蔬衰老，提升果蔬保鲜品质[58]。蛋白质在生物体行使功能中起着关键作用，现阶段利用蛋白质组学研究果蔬采后保鲜受到学者们的广泛关注，这不仅有助于了解延缓果蔬衰老的生理机制，还可识别果蔬采后感染的蛋白质标志物，为果蔬采后保鲜提供理论依据。本节从采后外源激素、低温贮藏、气调贮藏等3个方面综述了利用蛋白质组学研究采后典型商品化处理对果蔬品质调控的分子机制。

2.1 外源激素调控

乙烯是一种极其重要的植物激素，采后外源乙烯处理可以促进果蔬的成熟、衰老。LI 等[56]通过MALDI-TOF-TOF/MS 技术鉴定了香蕉果实中64个蛋白质斑点，发现这些蛋白质参与腺苷三磷酸（adenosine triphosphate,ATP）合成、ROS 清除、保护性化合物合成，表明这些表达量上调的蛋白质可能与香蕉果实中乙烯诱导的低温耐受性相关。LI等[59]使用液相色谱-电喷雾电离-串联质谱联用技术（liquid chromatography-electrospray ionization-tandem mass spectrometry,LC-ESI-MS/MS）对荔枝果肉进行了比较蛋白质组学分析，发现果肉中的蛋白质发生了变质和衰老，其中部分蛋白质参与生长素/乙烯调节，组蛋白去乙酰化酶和DNA甲基转移酶可能涉及荔枝衰老中ROS清除。

此外，脱落酸在果实成熟衰老中发挥着重要作用[60]。MOU 等[61]建 立 的SlAREB1-NOR 调 节 模 型证明了外源脱落酸（abscisic acid,ABA）可以诱导乙烯生物合成，调节番茄果实成熟。ZHOU 等[62]通过iTRAQ 技术研究了在桃采后期间关键的有色化合物（花青素、类胡萝卜素等）合成或降解相关的关键蛋白，结果发现：脱落酸处理能够调节关键蛋白对桃果实采后色素化合物的代谢途径，进而影响果实成熟情况；八氢番茄红素合酶（phytoene synthase,PSY）、ζ-胡 萝 卜 素 去 饱 和 酶（zeta-carotene desaturase,ZCD）和类胡萝卜素裂解双加氧酶（carotenoid cleavage dioxygenase,CCD）是桃果实采后调节类胡萝卜素代谢的关键功能蛋白，Mg-原卟啉Ⅸ螯合酶和脱镁叶绿酸a 加氧酶（pheophorbide a oxygenase,PAO）是调节采后叶绿素代谢的关键功能蛋白；而关键蛋白的调控，随桃皮色素化合物的量而变化。

2.2 低温贮藏调控

低温贮藏能够降低果蔬采后的呼吸作用强度，抑制微生物的生长繁殖，从而减缓果蔬的后熟过程并延长果蔬的贮存期，是一种较理想的保鲜手段。LIN 等[5]通过iTRAQ 技术发现：马铃薯在低温贮藏条件下，蔗糖、葡萄糖、果糖等可溶性糖含量明显升高；低温能诱导15 种热休克相关蛋白表达，它们通过单独或协同作用，参与细胞损伤的防治，抑制发芽和腐烂。MATA等[37]研究了低温贮藏对番茄采后成熟的影响，通过对蛋白质表达水平的分析发现，低温条件下乙烯的合成水平快速下降，可能是因为乙烯信号转导途径发生了变化，这对采后番茄果实的保藏提供了指导。YUAN 等[63]使用2-DE 技术对葡萄果实冷藏过程中蛋白质组进行比较，并采用MALDI-TOF 鉴定和定量了79 种冷藏过程中的调控蛋白，发现葡萄在采后冷藏期间，参与冷响应蛋白（如抗氧化酶）的防御反应被快速诱导，使组织快速适应环境压力，证实参与碳水化合物代谢途径（例如糖酵解途径）的蛋白质表达水平显著下调，说明在低温条件下可以维持葡萄果实品质并减少采后损失。

2.3 气调贮藏调控

气调贮藏是通过控制贮藏室呼吸气体浓度使果蔬呼吸速率最小化的方法，从而有效延长果蔬的贮藏寿命[57]。WANG 等[64]采用顶空GC-MS 指纹图谱和基于iTRAQ的定量蛋白质组学方法，研究了西兰花在O2/CO2气调环境中异味化合物积累与差异表达蛋白之间的关系，发现合适的气调环境使西兰花中糖酵解相关酶表达下调，从而降低糖酵解水平。说明适当调控O2/CO2气体环境可以提高西兰花的抗逆性，有效延长西兰花货架期。CHEN 等[65]采用iTRAQ定量蛋白质组学研究技术发现：莴苣在气调包装（modified atmosphere packaging,MAP）处理下，参与光合作用的蛋白质（如脱镁叶绿酸加氧酶、胆色素原脱氨酶等）得到显著调控；MAP还能调节抗氧化酶蛋白的表达，减少活性氧的积累，从而延缓莴苣的衰老。

3 果蔬采后蛋白质组学研究展望

果蔬采后商品化处理主要在果蔬的贮藏、运输和销售过程中进行，目的是调控其呼吸代谢、活性物质及色香味等品质变化。定量蛋白质组学本身的发展促进了果蔬分子生物学和系统生物学的研究。各种定量蛋白质组学技术和方法被广泛用于阐明主调控蛋白、细胞器功能、翻译后修饰和蛋白质相互作用，这些蛋白质组学研究进展，促进了对蛋白质分子功能更深入的了解，进而显著地推动了果蔬采后商品化处理理论研究水平的进步[66]。

蛋白质组学能够反映果蔬细胞内蛋白质组的组成成分、表达水平与修饰状态等的动态变化，但仅仅依靠蛋白质组学的结论还无法对果蔬采后生理生化变化进行全面解析和阐释。在利用蛋白质组学研究果蔬采后保鲜时，可以将蛋白质组学与基因组学、转录组学和代谢组学等相结合，进一步挖掘在生物体细胞生命活动进程中具有重要功能的蛋白质；同时，结合蛋白质与蛋白质、多肽、DNA、RNA等相关作用和生物信息学研究，为果蔬采后生物学研究的高速发展奠定扎实的理论基础。