新生儿遗传代谢病串联质谱筛查中氨基酸、有机酸及脂肪酸诊断临界值的探究

常剑锋 黄志伟 刘文晴

广东省肇庆市第二人民医院检验科，广东肇庆 526060

遗传代谢病（inborn errors of metabolism，IEM）为基因突变造成的酶和受体活性降低，继而引起中间或旁路代谢产物蓄积和终末代谢产物的缺乏，最终引发机体的生化代谢紊乱[1-3]。我国每年新增苯丙酮尿症（phenylketonuria，PKU）病例可达1200～1500例，IEM是造成出生缺陷、胎儿和新生儿死亡的不可忽视的重要原因[4]。由于产前诊断例如基因、细胞遗传学、生化和医学影像学诊断等取材技术和实验室检测技术的局限，导致IEM缺乏特异性诊断[5-7]。目前，临床应用具有高灵敏度和特异性的串联质谱技术（tandem mass spectrometry，TMS），对提高新生儿IEM的筛查效率作用显著[8]。本研究旨在研究新生儿遗传代谢病串联质谱筛查中氨基酸、有机酸和脂肪酸的诊断临界值，为新生儿遗传代谢病的串联质谱筛查提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2019年1～9月我市收治的确诊为患遗传代谢病活产儿98例，依据《新生儿疾病筛查技术规范》纳入患儿。其中汉族97例，回族1例，体重均＞2500g，出生Apgra评分均＞9分。新生儿出生7d内充分哺乳，7d时针刺足跟并采集微量血滴于Scheicher and Schuell 903滤纸上，室温晾干，形成滤纸干血片标本，送新生儿筛查实验室检测。

1.2 检测方法

代谢指标检测项目包括12个氨基酸、22个酰基肉碱及其相对应的比值。检测前优化串联质谱参数仪，平衡系统压力。使用打孔器取直径为3 mm的圆形滤纸片置于96孔聚丙烯板内。氨基酸、酰基肉碱内标原液和萃取液（1∶108）配置，每孔加入100μL。密封微孔板，恒温孵育并萃取氨基酸和酰基肉碱。使用非衍生化法在Wasters-QT Detector串联质谱仪中进行检测；试剂盒购自PE公司。

1.3 统计学方法

应用统计学软件SPSS19.0对数据进行统计分析。检验正态分布后，采用百分位数法制定各指标cut-off值；采用Wilcoxon秩和检验对本研究串联质谱cut-off值和上海新华医院进行比较，检验水准α=0.05。采用ROC曲线分析评价各指标的临床应用价值。

2 结果

2.1 新生儿遗传代谢病诊断结果

本研究的98例患儿中氨基酸代谢异常55例、有机酸代谢异常26例及脂肪酸代谢异常17例。分别为苯丙酮尿症55例、甲基丙二酸血症20例、异戊酸血症3例、原发性肉碱缺乏症2例、β-酮硫解酶缺乏症1例、脂肪酸氧化代谢障碍9例、中链酰基辅酶7脱氢酶缺乏症1例。

2.2 新生儿氨基酸和酰基肉碱Cut-off值

Wilcoxon秩和检验与上海新华医院的cut-off值比较发现，本研究新生儿串联质谱cut-off值与上海新华医院有相近之处，但ARG（精氨酸）、GLY（甘氨酸）、TYR（酪氨酸）、ORN（鸟氨酸）、LEU（亮氨酸）、VAL（缬氨酸）、C5（异戊酰肉碱）、C12（十二碳酰肉碱）、C0/（C16+C18）[游离肉碱/（棕榈酰肉碱+十八碳酰肉碱）]cut-off值的下限与上海新华医院指标间的差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 新生儿各氨基酸和酰基肉碱指标的Cut-off值（μmol/L）

2.3 新生儿氨基酸和酰基肉碱临床诊断临界值

ROC 曲线分析显示：ARG、GLY、TYR、ORN、LEU、VAL、C5、C12、C0/（C16+C18）的AUC均＞0.5均有诊断效能，其中GLY、TYR、ORN、VAL及C0/（C16+C18）的AUC均＞0.9，诊断效能显著。根据约登指数计算方法得到各指标的诊断临界值分别为5.57、247.32、86.28、82.94、116.82、72.14、0.07、0.03、8.16μmol/L。见表2。

表2 新生儿氨基酸和酰基肉碱临床诊断临界值及ROC曲线下面积比较

3 讨论

IEM是因先天性基因缺陷导致蛋白质功能异常，进而致使体内氨基酸、有机酸以及脂肪酸等众多生化产物在合成、代谢和转运等过程中出现紊乱[9-11]。TMS技术能够实现在2min内对一个血样本进行几十种代谢物分析，并同时进行几十种IEM的检测，其高度的灵敏度、特异性和选择性，为扩展代谢疾病筛查和提高检测效率开拓出新的途径[12-13]。本研究显示新生儿串联质谱cut-off值与上海新华医院有相近之处，但部分检测指标仍差异显著，其cut-off值的下限与上海新华医院间的差异有统计学意义，其中ARG、GLY、TYR、ORN、LEU、VAL、C5、C12、C0/（C16+C18）的最佳临床诊断临界值分别 为5.57、247.32、86.28、82.94、116.82、72.14、0.07、0.03、8.16。但只有GLY、TYR、ORN、VAL及C0/（C16+C18）的诊断效能较高。虽然IEM筛查敏感性很高，但假阳性预测值也较高。为进一步优化检测指标、提高筛查效率、控制IEM带来的不可逆性损伤、减少召回人数、降低筛查费用，只有扩大新生儿疾病筛查覆盖率、增加筛查的病种、增加筛查点、扩大筛查面，才能得出能客观反映遗传代谢病筛查情况的资料[14]。因此本研究后续研究将继续分析IEM筛查实验联同不同性别、孕周、出生季节和出生地域的结果，以提高筛查效率。

综上所述，本研究建立了适合人群的正常参考范围，对提高阳性预测值提供参考。随着新生儿代谢疾病筛查量的不断增加，串联质谱IEM筛查的各指标cut-off值也将会随着阳性预测值范围的变化而作出相应的调整。