铁皮石斛种子液体静置培养及其对离体植株生长的影响

董志渊，李林玉，马维思，杨 斌，王 馨，严世武，杨丽英

(云南省农业科学院药用植物研究所, 云南 昆明 650205)

【研究意义】铁皮石斛(Dendrobiumofficinale)为兰科(Orchidaceae)石斛属附生植物，产于中国浙江、安徽、云南、广西、四川等地，生于海拔1600 m山地半阴湿的岩石上[1]。铁皮石斛以茎入药，具有益胃生津、滋阴清热等功效[2]。铁皮石斛等石斛属植物的种子在果实成熟时仍处于原胚阶段，没有胚根、胚轴、胚芽和子叶的分化，在自然条件下，需要共生菌提供营养促进萌发，但萌发率较低[3-5]。采用无菌萌发技术，播种石斛种子在灭菌的培养基上，可显著提高种子的萌发率[6]。种子无菌萌发及离体繁殖已成为铁皮石斛种苗规模化生产的主要途径。【前人研究进展】目前，铁皮石斛种子无菌萌发，主要采用固体培养基[7]。史俊和赵荣[8]研究发现，转速120 r/min 的振荡液体培养，可促进铁皮石斛种子的无菌萌发和原球茎的生长，解决了固体培养存在的播种量小、继代转接工作量大等问题。【本研究切入点】本实验前期研究发现，铁皮石斛种子在静置的液体培养液中也能萌发形成原球茎。但关于液体静置培养对原球茎发育及其离体植株生长的影响尚不清楚。【拟解决的关键问题】采用液体培养基，静置培养铁皮石斛种子，研究不同基本培养基对种子萌发、原球茎发育的影响以及来自不同液体培养基的原球茎及其体积大小对铁皮石斛离体植株生长的影响，为优化铁皮石斛液体培养提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

铁皮石斛(Dendrobiumofficinale)蒴果产自浙江省乐清市，果荚饱满，颜色为黄绿色，未开裂，外表无病斑。

1.2 试验方法

1.2.1 种子液体静置培养 蒴果冲洗干净后，超净工作台上70 %乙醇浸泡30 s，4.0 %次氯酸钠溶液浸泡消毒20 min，无菌水冲洗3次，切除蒴果两端，从中间切开蒴果，分为2份，分别将种子撒入50 mL液体培养基中进行培养。培养基分别为1/2B5、1/2N6、1/2MS、1/2花宝1号、1/2花宝2号等5种基本培养基，均加入NAA 0.5 mg/L、水解酪蛋白1 g/L、蔗糖30 g/L。培养基pH值5.8～6.2。培养条件为温度25 ℃，光照强度4800 lx，光照时间10 h/d。

培养过程中，每10 d观察铁皮石斛种子萌发生长情况。培养40 d，显微测量种子萌发形成原球茎的直径。每种培养基设置3个重复，每个重复测量约300个原球茎的直径。以直径长度每200 μm 为单位，将原球茎划分为6组。按如下公式统计原球茎直径分布情况。

某一组的原球茎比例 (%)= (该组原球茎数目 ÷ 测量原球茎数目)× 100

1.2.2 原球茎分选和培养 采用灭菌的30目(筛孔600 μm)、40目(筛孔425 μm)的金属筛，将1/2B5、1/2N6、1/2MS培养基培养获得的原球茎依次过筛分级，并悬浮于无菌蒸馏水中，分别吸取原球茎悬浮液，转接至固体培养基。每瓶固体培养基约400个圆球茎。固体培养基配方均为1/2MS + 水解酪蛋白1 g/L + NAA 0.5 mg/L + 活性炭2 g/L。培养90 d后，观察不同处理(液体培养基、原球茎大小)，离体植株的形态特征。按如下公式统计不同形态类型的比例。

某一形态类型的比例 (%)= (该形态类型数目 ÷ 离体植株数目)× 100

1.2.3 数据分析 采用DPS统计软件，对测量数据进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 不同基本培养基对铁皮石斛种子萌发生长的影响

铁皮石斛种子液体静置培养过程中，基本培养基对种子萌发影响明显。1/2B5和1/2N6培养基，种子培养10 d，明显膨大，颜色持续变绿；培养20 d时，肉眼观察到原球茎的形成；培养40 d时，大部分种子发育形成原球茎(图1)。1/2MS培养基中，种子发育进程明显慢于1/2 B5和1/2 N6培养基，但培养40 d也可形成原球茎。1/2花宝1号培养基和1/2花宝2号培养基，部分种子不能正常萌发，而发育形成的原球茎颜色普遍呈黄白色，出现原球茎畸形的情况。

测量原球茎直径，1/2B5、1/2N6、1/2MS、1/2花宝1号和1/2花宝2号培养基，种子发育形成原球茎的直径依次是438.56、577.89、401.03、348.58和336.56 μm，1/2N6培养基培养的原球茎直径最大，而1/2花宝2号培养基的原球茎直径最小。方差分析结果表明，不同培养基的原球茎直径差异极显著(P= 0.00 < 0.01)，1/2N6培养基的原球茎直径显著大于1/2MS、1/2花宝1号、1/2花宝2号培养基。

分析不同培养基原球茎直径分布情况，结果表明，1/2B5培养基中，原球茎直径主要在200～600 μm，所占比例为91.24 %(图2)；1/2N6培养基中，原球茎直径主要在400～800 μm，所占比例为81.30 %(图3)；1/2MS培养基中，原球茎直径主要在200～600 μm，所占比例为95.90 %(图4)；1/2花宝1号培养基中，原球茎直径主要在200～600 μm，所占比例为99.20 %(图5)；1/2花宝2号培养基中，原球茎直径主要在200～600 μm，所占比例为98.84 %(图6)。

2.2 离体植株的形态特征

将1/2B5、1/2N6、1/2MS液体培养基培养40 d产生的原球茎，转接到固体培养基上(图7-1)。培养90 d，原球茎发育形成离体植株(图7-2)。依据形态特征可分为3种类型：发育形成1～3片叶片和1～3个根，具单芽的正常植株(图7-3)；具2个以上芽的多芽植株(图7-4、图7-5、图7-6)；原球茎愈伤组织化，未形成植株(图7-7、图7-8)。统计不同形态类型的比例，结果表明，来自1/2N6培养基的原球茎，发育形成正常单芽植株比例较高，1/2B5培养基的原球茎发育形成多芽植株比例较高，1/2MS培养基的愈伤组织比例较高；直径大于30目的原球茎发育形成正常单芽植株比例普遍高于40目的原球茎，相应地多芽植株、愈伤组织比例较低(表1)。

图1 液体静置培养获得的原球茎Fig.1 Protocorms derived from static liquid culture

图2 1/2 B5培养基的原球茎直径分布情况Fig.2 Diameter distribution of protocorms cultured in 1/2B5 medium

图3 1/2 N6培养基的原球茎直径分布情况Fig.3 Diameter distribution of protocorms cultured in 1/2N6 medium

图4 1/2 MS培养基的原球茎直径分布情况Fig.4 Diameter distribution of protocorms cultured in 1/2MS medium

图5 1/2花宝1号培养基的原球茎直径分布情况Fig.5 Diameter distribution of protocorms cultured in 1/2Hyponex No.1 medium

图6 1/2花宝2号培养基的原球茎直径分布情况Fig.6 Diameter distribution of protocorms cultured in 1/2Hyponex No.2 medium

方差分析结果表明，液体基本培养基对正常的单芽植株比例影响不显著(P= 0.35 >P0.05)，而原球茎大小对单芽植株比例有极显著影响(P=0.00

1: 转接在固体培养基上的原球茎；2: 原球茎发育形成离体植株；3: 单芽植株；4～6: 多芽植株； 7～8: 愈伤组织.1: Protocorms on solid medium; 2: Plantlets deriving from protocorms; 3: Single bud; 4-6: Multiple bud; 7-8: Callus deriving from protocorm图7 原球茎离体培养形成的植株形态特征Fig.7 Morphology of plantlets derived from protocorms in vitro

3 讨 论

植物细胞或组织液体培养一般采用振荡培养的方式[9-11]。液体振荡培养的铁皮石斛原球茎重量极显著高于固体培养[12]。采用液体静置培养方式，铁皮石斛种子能萌发形成原球茎，且转接在固体培养基上可生长发育为离体植株。液体静置培养简化了石斛液体培养条件，有望加快液体培养在石斛人工繁育生产中的应用。

表1 原球茎发育形成的植株类型Table 1 Mythological types of plantlets derived from protocorms

4 结 论

铁皮石斛种子液体静置培养中，基本培养基是影响原球茎发育的重要因素，1/2N6是较适宜的培养基；来自不同液体培养基的原球茎及其大小显著影响离体植株的生长，大于30目的原球茎发育形成正常单芽植株比例较高。