提取鼠曲草粗多糖去除蛋白质方法的比较研究

刘品华，谢景文，康照金，冯亚娟，汪 帆

(曲靖师范学院化学与环境科学学院，云南 曲靖 655011)

【研究意义】鼠曲草(GnaphaliumaffineD. Don)，又称清明菜，菊科，簇生，一年生草本，生于海拔1600～2700 m的田埂、荒地、路旁，尤以稻田最常见。清明节前民间采集嫩尖食用。每100 g嫩茎叶中含水分85 g、蛋白质3.1 g、脂肪0.6 g、碳水化合物7 g、热量192.56 kJ、粗纤维2.1 g、灰分2.4 g、钙218 mg、磷66 mg、铁7.4 mg、胡萝卜素2.19 mg、硫胺素0.03 mg、核黄素0.24 mg、尼克酸1.4 mg、抗坏血酸28 mg[1]。茎叶入药，有化痰止咳、清热利湿，活血降压，治气喘、咳嗽痰多、湿热黄疸以及溃疡的功效[2]。有研究表明，鼠曲草具有多种生物活性，在营养保健、生物农药、化妆品等方面都有一定的应用价值，资源丰富，药食两用，是一种极具开发利用潜质的生物资源[3]。目前已有报道的天然多糖化合物约有300多种[4]。根据多糖来源主要分为植物类和动物类多糖，普遍存在于植物、动物、菌类、藻类等中，是由10个以上各种单糖组成的天然高分子化合物，其相对分子质量可高达数万甚至数百万，是自然界中含量和种类最为丰富的生物聚合物，多数具有突出生物活性的多糖都具有β(1→3)-D-葡聚糖的主链结构，是一类具有重要活性的物质[5-6]，有免疫调节、抗病毒、抑制抗肿瘤、抗衰老、抗凝血、抗寄生虫、抗辐射、抗溃疡、镇痛、预防急性肾衰、降血脂、降血糖、保护胃肠、抗氧化等功效，且毒副作用小，不易造成残留等优点而备受关注[7-11]。天然植物中往往是多糖与蛋白质共存，还有些以糖蛋白复合物的形式存在，这使得蛋白质的分离变得尤为重要，如何有效去除蛋白质保留多糖成为一个突出的问题。【前人研究进展】由于不同植物中粗多糖、蛋白质的结构和性质不同，纯化粗多糖时最佳去除蛋白质方法也不同，其主要有沉淀法、酶法及酶法与其它的组合方法。从鼠曲草中提取粗多糖去除蛋白质还未见相关报道。【本研究切入点】提取纯化粗多糖是研发的基础，为此研究比较了8种去除鼠曲草粗多糖中蛋白质方法的效果。【拟解决的关键问题】研究从鼠曲草中提取粗多糖，最优去除蛋白质和保留粗多糖的技术方法，旨在为深入研究和开发鼠曲草粗多糖提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

鼠曲草(云南省曲靖市麒麟区郊外田间地头采摘)，去花蕾后80 ℃烘干，粉碎过60目筛备用；考马斯亮蓝G250(南京奥多福尼生物科技有限公司，AR)；牛血清白蛋白(南京奥多福尼生物科技有限公司，BR)；木瓜蛋白酶(30万 U/g，北京鑫达食品添加剂有限公司，食品级)，其他均为AR试剂。

紫外可见分光光度计(TU-1810，北京普析通用仪器有限责任公司)；电子天平[AL204-IC，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司]；台式离心机(LD-4，常州天瑞仪器有限公司)；离心机(低速离心机，常州国华电器有限公司)；数显恒温水浴锅(HH-S2s，金坛市大地自动化仪器厂)；超声波仪(PS-40，深圳市超声艺达科技有限公司)；旋涡混合器(XH-C上海汗诺仪器有限公司)。

1.2 试验方法

1.2.1 多糖的提取 称一定量鼠曲草干粉备用，加入5倍鼠曲草质量的纯水浸润，然后加入4倍水量的无水乙醇(调整乙醇浓度为80 % vol)，置于400 W超声仪中超声30 min，抽滤，弃除上清液，不溶物用80 % vol乙醇洗涤2次，转移至烧杯中，加入10～15倍不溶物的纯水，沸水浴2 h，取出冷却至室温，滤渣用同样条件再重复提取2次, 合并3次提取液，得试样储备液。

1.2.2 蛋白质的检测 参照SN/T 3926-2014标准进行蛋白质检测。准确称取牛血清白蛋白9.8 mg，用100 mL容量瓶加纯水溶解后定容至刻度，得0.98 mg/mL牛血清白蛋白储备液。分别吸取牛血清白蛋白储备液0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL至15 mL试管中，加纯水补充至1.0 mL，再向各试管中加入5.0 mL考马斯亮蓝G-250溶液(准确称取100 mg考马斯亮蓝G250，溶于95 %的乙醇50 mL中，再加入85 %的磷酸100 mL，用纯水定容至1000 mL容量瓶，过滤，得清液)，用漩涡混合器混合均匀后，室温放置2 min，以零管为空白，用1 cm比色管在595 nm波长处测定吸光度，用标准白蛋白质量(μg)为横坐标，吸光度(A)为纵坐标作图，得回归方程：y=0.0375x+0.6250，R2=0.9993。取1.0 mL试样储备液，同标准曲线方法检测吸光度(用水代替试样储备液作空白)，计算蛋白质含量(下述方法中稀释的按稀释倍数计算)。

1.2.3 多糖的检测 参照SN/T 4260-2015方法进行粗多糖检测。准确称取干燥至恒重的葡萄糖0.1000 g，用纯水定容至1000 mL容量瓶得标准葡萄糖溶液(浓度为100 μg/mL)。分别吸取标准葡萄糖溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL至15 mL具塞试管中，补充纯水至1.0 mL，向试液中加入新蒸苯酚配制的5 %的溶液1.0 mL，然后垂直液面加入5.0 mL浓硫酸，静止10 min，使用旋涡混合器混合均匀后，将具塞试管放置于30 ℃水浴中30 min，用1 cm比色管在490 nm处检测吸光度，用葡萄糖质量(μg)为横坐标，吸光度(A)为纵坐标作图，得回归方程为y=0.0113x+0.0117，R2=0.9997。分别取1.0 mL试样储备液，同标准曲线法检测吸光度，计算粗多糖含量(下述方法中稀释的按稀释倍数计算)。

1.2.4 碱性法 在5支50 mL离心试管中分别取25.0 mL试样储备液，用1 mol/L氢氧化钠溶液分别调pH值为8、9、10、11、12，混合均匀后，静置过夜，于4500 r/min离心10 min，上清液转移到50 mL容量瓶中，沉淀加5 mL对应pH值的氢氧化钠水溶液旋涡震荡后离心，清液并入容量瓶，沉淀同法再重复1次。清液用1 mol/L盐酸溶液调整pH≈7，然后用纯水定容至刻度，摇匀得检测液，同1.2.2、1.2.3中方法测定蛋白质、粗多糖含量。

1.2.5 酸性法 在5支50 mL离心试管中分别取25.0 mL试样储备液，用1 mol/L盐酸分别调pH值为2.0、2.5、3.0、3.5、4.0，混合均匀后，放置于4 ℃冰箱中静置过夜[12-13]，于4500 r/min离心10 min，上清液转移到50 mL容量瓶中，沉淀加5 mL对应pH值的盐酸水溶液旋涡震荡后离心，清液并入容量瓶，沉淀再同法重复1次。用纯水定容至刻度得检测液，同1.2.2、1.2.3方法测定蛋白质、粗多糖含量。

1.2.6 醋酸铅法 在5支50 mL离心试管中各取25.0 mL试样储备液，分别滴加浓度为0.001、0.005、0.010、0.020、0.030 g/mL醋酸铅溶液至无沉淀析出，于4500 r/min离心10 min，上清液转移到50 mL容量瓶中，沉淀加5 mL纯水旋涡震荡后离心，清液并入容量瓶，沉淀再同法重复1次。用纯水定容至刻度得检测液，同1.2.2、1.2.3方法测定蛋白质、粗多糖含量。

1.2.7 三氯乙酸法 在5个50 mL容量瓶中分别加入0.25、0.50、1.50、2.50、3.50 g三氯乙酸，用试样储备液定容至刻度(浓度分别为5.0、10.0、30.0、50.0、70.0 mg/mL)。分别转入5支50 mL离心试管中旋涡震荡20 min后静置30 min，于4500 r/min离心15 min取上清液得检测液，同1.2.2、1.2.3方法测定蛋白质、粗多糖含量。

1.2.8 Sevag法 分别在5个250 mL锥形瓶中，吸取150.0 mL试样储备液，按试样储备液与Sevag试剂(氯仿∶正丁醇=4∶1，v/v)为5∶1(v/v)混合后剧烈震荡20 min[13～14]，转移至50 mL离心管中于4500 r/min离心10 min，弃除下层有机相以及中间生成的凝聚物。分别各处理1、2、3、4、5次后，收集离心的上层清液得检测液，同1.2.2、1.2.3方法测定蛋白质、粗多糖含量。Sevag试剂更改为，氯仿∶正丁醇=5∶1同法操作进行考查。

1.2.9 木瓜蛋白酶—碱性法 按参照文献[15]作适当修改。在1 L的锥形瓶中取试样储备液500 mL、木瓜蛋白酶1.5 g混匀，置于60 ℃水浴2 h，沸水浴10 min，待试液冷却至室温得水解液。在5支50 mL离心试管中分别各取25.0 mL水解液，用1 mol/L氢氧化钠溶液分别调pH值为8、9、10、11、12，混合均匀后，静置过夜，4500 r/min离心10 min，上清液转移到50 mL容量瓶中，沉淀加5 mL对应pH值的氢氧化钠水溶液旋涡震荡后离心，清液并入容量瓶，沉淀再同法重复1次，合并的清液调整pH≈7。用纯水定容至刻度。从容量瓶中取出10 mL到50 mL离心管中，再加入40 mL无水乙醇，4500 r/min离心10 min弃除上清液，沉淀加80 %的乙醇约10 mL震荡、离心，沉淀再同法重复洗涤2次。固体转移至10 mL容量瓶中用纯水定容至刻度得不同pH值沉淀处理后制得的检测液，同1.2.2、1.2.3方法检测蛋白质、粗多糖含量。

1.2.10 木瓜蛋白酶—三氯乙酸法 在5个50 mL容量瓶中分别加入0.25、0.50、1.50、2.50、3.50 g三氯乙酸，用1.2.9中制得的水解液定容至刻度，按1.2.7方法处理后，取离心后的清液10 mL到50 mL离心管中，再加入40 mL无水乙醇，以下步骤同1.2.9。

1.3 数据处理

(1)

Xi：蛋白质清除率(%)；R1：试样储备液中蛋白质质量(μg)；R2：上述各方法除蛋白质后计算为与R1同等体积中残留蛋白质的质量(μg)。

(2)

Yi：多糖损失率(%)；T1：试样储备液中粗多糖质量(μg)；T2：上述各方法除蛋白后检测液中粗多糖计算为与T1同等体积中的剩余粗多糖质量(μg)。

精密度采用在重复性条件下获得的二次独立测试结果的绝对差值不超过算术平均值的10 %。以二次独立测定结果的算术平均值为结果表示。

综合指标(Zi)参考文献[16]作适当修改。通过蛋白质的清除率和多糖损失率加权重进行评价考查。

计算公式：Zi=(100-Yi)×0.5+Xi×0.5

(3)

2 结果与分析

2.1 碱性法

取鼠曲草2 g加约50 mL水煮沸后离心，清液滴加碘溶液，不显蓝色，说明鼠曲草茎叶中不含淀粉，符合SN/T 4260标准检测粗多糖含量要求。检测得知鼠曲草干粉中粗多糖含量3.262 %，蛋白质含量0.375 %。

强碱可以裂解多糖与蛋白的连接键，同时利用蛋白质在等电点时溶解度最低的性质，沉淀去除多糖提取液中的碱性蛋白[12]。

由表1可知，随着溶液碱性的增强，蛋白质的清除率也逐渐增加，pH12的蛋白质清除率比pH值11的增加3.52 %，但粗多糖损失率也增加2.55 %，综合指标(Zi)值仅增加0.49 %，碱性越强多糖糖苷键更易被破坏，建议pH不超过11。

2.2 盐酸酸法

酸法与碱法的原理相似，是酸性蛋白质由于等电点的作用而沉淀。酸性越强温度越高多糖中糖苷键更易断裂，造成多糖损失，采用酸法应在低温下进行。

表1 碱性法检测结果Table 1 The test results of alkaline process

表2 酸性法检测结果Table 2 The test results of acid process

由表2可知，综合指标(Zi)最好的是pH值为4，最高蛋白质清除率只有28.83 %，说明鼠曲草中的多数蛋白质不是酸性蛋白，清除率较低，不建议用酸法去除鼠曲草粗多糖中的蛋白质。

2.3 醋酸铅法

重金属盐类与蛋白质结合生成不溶性重金属蛋白质复合物而沉淀析出，适合于蛋白质含量较高的多糖溶液。

由表3可知，醋酸铅浓度为0.03 g/mL时，综合指标(Ze)考查最好，蛋白质清除率达到97.55 %，是最佳条件。

2.4 三氯乙酸法

三氯乙酸法(Trichloroacetic acid，TCA)是根据蛋白质在有机酸的作用下形成不可逆沉淀。一般操作方法是在多糖水溶液中滴加3 %等体积的TCA，混匀后静置过夜，离心去除胶状沉淀，重复以上的操作即可得到无蛋白的多糖溶液[12]。

由表4可知，随着三氯乙酸用量的增加，总体上蛋白质的清除率和多糖的损失率都在升高。综合指标评价三氯乙酸浓度70 mg/mL时最好，比三氯乙酸浓度50 mg/mL提高1.23 %。由于三氯乙酸法脱蛋白质时反应较为剧烈，当三氯乙酸浓度过高时会引起多糖结构的破坏，导致多糖降解分子变小，产生不期望的结果[13,15]，建议三氯乙酸浓度控制在50～70 mg/mL。

表3 醋酸铅法检测结果Table 3 The test results of lead acetate method

表4 三氯乙酸法检测结果Table 4 The test results of trichloroacetic acid method

2.5 Sevag法

Sevag法的原理是根据蛋白质在氯仿等有机溶剂中变性的特点进行分离[17]，虽然该方法条件温和，是脱蛋白的经典方法，但需要反复处理样品多次，而且只能去除游离的蛋白质，对于与多糖紧密结合的蛋白质(糖蛋白)无法去除，除蛋白质时变性的胶状物会导致多糖损失[12]。

由表5得知，Sevag法粗多糖的损失率都高于蛋白质的清除率。氯仿∶正丁醇=4∶1重复5次的蛋白质清除率为16.92 %，综合指标考查最好为47.89 %。氯仿∶正丁醇=5∶1的重复5次的蛋白质清除率为7.72 %，综合指标考查最好为48.34 %，该方法不适用于鼠曲草粗多糖中去除蛋白质。

2.6 酶法

酶的作用是使多糖提取液中蛋白质水解生成小分子氨基酸，达到去除粗多糖中蛋白质的目的。因为酶也是一种蛋白质，所以水解后还需用其它脱蛋白质和脱氨基酸方法除去酶和氨基酸。为此考查了木瓜蛋白酶处理后再用碱性法、三氯乙酸法除去木瓜蛋白酶，用80 %乙醇洗涤除去氨基酸的效果。

2.6.1 木瓜蛋白酶—碱性法 由表6与表1比较可知，酶—碱法处理后去除蛋白质效果好于单用碱处理的方法。pH值9时综合指标最高，达到79.48 %，与pH值10、pH值11分别只相差0.51 %、0.95%，所以该法pH要控制在9～11。

表5 Sevag法检测结果Table 5 The test results of Sevag method

注：a表示氯仿∶正丁醇=4∶1；b表示氯仿∶正丁醇=5∶1。
Note：ashowed Chloroform ∶ N-butanol = 4∶1 (Vol);bshowed Chloroform ∶ N-butanol = 5∶1 (Vol).

表6 木瓜蛋白酶—碱性法检测结果Table 6 The test results papain-alkaline method

2.6.2 木瓜蛋白酶—三氯乙酸法 三氯乙酸有终止木瓜蛋白酶的作用[18]。由表7可知，木瓜蛋白酶—三氯乙酸法除去鼠曲草中的蛋白质较为彻底。但粗多糖的损失率整体都很高，从综合指标考查，建议三氯乙酸浓度要小于5 mg/mL。

2.7 8种方法中最优效果比较

8种方法最优效果比较见图1。

表7 木瓜蛋白酶—三氯乙酸法检测结果Table 7 The test results of papain-trichloroacetic acid method

3 讨 论

谢丽源等比较了Sevag法和三氯乙酸法去除桑黄多糖提取液中蛋白质的情况，结果显示三氯乙酸法去除蛋白质的效果优于Sevag法[19]，与我们的结果一致。多糖主要有两种存在形式，一种是单糖由苷键链接形成的多糖，另一种是由糖链与肽链结合形成的糖蛋白。三氯乙酸法、碱法、酸法都存在破坏糖苷键或改变活性的可能，浓度需尽可能的低。醋酸铅法存在去除糖蛋白的可能。蛋白酶法是否对糖蛋白有水解作用需进一步的研究。所以在去除蛋白质的过程中要充分考虑多糖的存在形式和希望得到的多糖形式。

1:碱法(pH=13);2:碱法(pH=4)；3:醋酸铅法(0.03 g/mL);4:三氯乙酸法(6.54 %);5:Sevag法(4∶1)5次；6:Sevag法(5∶1)5次；7:酶-氢氧化钠法(pH=9);8:酶-三氯乙酸法(0.5 %)图1 8种方法中最优效果的比较Fig.1 Comparison of the best effects of the 8 methods

从图1可见，提取鼠曲草粗多糖去除蛋白质效果排序是醋酸铅法>三氯乙酸法>木瓜蛋白酶—三氯乙酸法>木瓜蛋白酶—氢氧化钠法>氢氧化钠法>盐酸法 >Sevag法(氯仿∶正丁醇=4∶1)>Sevag法(氯仿∶正丁醇=5∶1)。其中醋酸铅法、三氯乙酸法、木瓜蛋白酶—三氯乙酸法效果较好，可依据鼠曲草粗多糖提取纯化目的要求进行选择。Sevag法、碱法、酸法不建议采用。从醋酸铅法和木瓜蛋白酶—三氯乙酸法的结果比较推测，鼠曲草中的粗多糖主要由单糖构成。

4 结 论

上述8种鼠曲草去除蛋白质的方法中。木瓜蛋白酶—三氯乙酸法蛋白质清除率可达到100 %，但粗多糖损失率也较高，适用于蛋白质含量要求低的粗多糖分离。醋酸铅法蛋白质清除率可达到97 %，粗多糖损失率相对较低，适用于量较大的粗多糖的提取分离。