舌鳞状细胞癌中Survivin的表达及与上皮细胞-间质转化的关系

丁丹丹，程如玉，韩 瑞，张 姗，丁 翔，王尚华，王倩倩，韩影影，徐锦程

舌鳞状细胞癌(tongue squamous cell carcinoma, TSCC)是口腔癌中最常见的恶性肿瘤，男、女性均可发病，其发病率有逐年上升趋势，并且发病年龄年轻化[1]。上皮细胞-间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是鳞状细胞癌浸润和转移的关键机制之一，因此探讨TSCC的EMT发生机制，对于改善预后，提高患者的生存率至关重要。Survivin是迄今为止发现的凋亡抑制蛋白家族(inhibitor of apoptosis protein, IAP)中凋亡抑制作用最强的蛋白，在多种肿瘤组织中高表达，可抑制肿瘤细胞的凋亡，促进肿瘤细胞的侵袭和转移[2]。目前，Survivin与TSCC组织EMT表型的关系尚无相关报道。本文检测Survivin和EMT相关蛋白E-cadherin和N-cadherin在TSCC中的表达，分析其与临床病理特征的关系，以期为TSCC的相关机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 临床资料收集蚌埠医学院第一附属医院口腔颌面外科2015年1月～2018年12月手术切除且经病理确诊的TSCC蜡块标本63例。所有患者均行手术切除，术前未接受放、化疗等。患者年龄29～81岁，中位年龄55岁，男性45例，女性18例。肿瘤直径<2.0 cm者27例，2.0～4.0 cm者23例，>4.0 cm者13例。依据AJCC(2010年)标准对临床分期进行划分，Ⅰ+Ⅱ期37例，Ⅲ+Ⅳ期 26例。根据WHO(1997)口腔鳞状细胞癌的分类标准对病理分级进行划分，Ⅰ级22例，Ⅱ级21例，Ⅲ级20例。发生区域性淋巴结转移者24例，其中有18例淋巴结转移数目为1～3枚，6例淋巴结转移数目>3枚；未发生区域性淋巴结转移者39例。选取8例符合要求的新鲜TSCC组织标本，取材收集后，即刻转移到-80 ℃冰箱中保存。另选择63例相应癌旁正常上皮组织作为对照组。

1.2 试剂兔抗人Survivin、E-cadherin、N-cadherin抗体购自北京中杉金桥公司；即用型免疫组化检测试剂盒、DAB显色剂及兔抗人β-actin抗体，均购自福州迈新公司；稀释液及SDS-PAGE电泳试剂盒，均购自北京碧云天公司；PVDF膜购自Millipore公司。

1.3 免疫组化TSCC组织蜡块标本均制成4 μm厚的切片，免疫组化染色采用EnVision法。一抗用PBS缓冲液代替作为阴性对照，而已知的TSCC组织切片则作为阳性对照。一抗Survivin、E-cadherin及N-cadherin稀释比均为1 ∶300。

1.4 结果判定Survivin主要表达于细胞核，E-cadherin主要表达于细胞膜，N-cadherin表达于细胞膜和(或)细胞质。按细胞着色强度计分：无着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；每例随机选择10个热点区域的细胞数，按阳性细胞百分数计分：≤5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，>50%为3分。将两项得分结果相乘：≥3分为阳性，<3 分为阴性。

1.5 Western blot法常规提取组织中蛋白，采用SDS-PAGE胶电转移至PVDF膜上，室温浸泡于5%脱脂牛奶中封闭2 h，加入一抗Survivin、E-cadherin、N-cadherin以1 ∶500的比例稀释，β-actin以1 ∶1 000比例稀释，4 ℃过夜。次日，TBST洗涤2～3次后孵育二抗(辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG 1 ∶2 000)2 h，TBST洗涤2～3次。暗室中将混匀的发光液均匀涂在PVDF膜上，使用凝胶成像系统拍照，并通过图像分析软件测定各条带的灰度值。

1.6 统计学分析应用SPSS 16.0软件进行统计学分析，采用χ2检验分析Survivin与TSCC临床病理特征的关系；采用Pearson相关检验对Survivin表达与EMT标志蛋白的免疫组化结果进行相关性分析，采用t检验分析统计组间的差异，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Survivin、E-cadherin及N-cadherin在TSCC和癌旁正常上皮组织中的表达免疫组化检测结果显示，TSCC组织中Survivin阳性主要定位于细胞核，E-cadherin阳性主要定位于细胞膜，N-cadherin阳性定位于细胞膜和(或)细胞质(图1～7)。统计分析发现，三者在TSCC和癌旁正常组织中的阳性率组间差异有统计学意义(P<0.01，表1)。

2.2 Survivin、E-cadherin及N-cadherin与TSCC临床病理特征的关系统计结果显示，临床分期及病理分级越高、有淋巴结转移的TSCC组织中Survivin阳性率明显增高，差异有统计学意义(P<0.05)，其表达与肿瘤直径、性别、年龄均无关(P>0.05)。E-cadherin和N-cadherin表达与TSCC临床分期、病理分级、淋巴结转移相关，差异有统计学意义(P<0.05)；与肿瘤直径、患者性别及年龄均无关(P>0.05，表2)。Western blot实验结果进一步证实与免疫组化结果一致(图8)。

图1 Survivin在癌旁正常上皮组织中的表达,EnVision法图2 Survivin在无淋巴结转移TSCC组织中的表达,EnVision法 图3 Survivin在有淋巴结转移TSCC组织中的表达,En-Vision法 图4 E-cadhrin在癌旁正常上皮组织中的表达,EnVision法 图5 E-cadher-in在TSCC组织中的表达,EnVi-sion法 图6 N-cadherin在癌旁正常上皮组织中的表达，EnVision法 图7 N-caderin在TSCC组织中的表达，EnVision法

表1 TSCC和癌旁正常组织中Survivin、E-cadherin和N-cadherin的表达[n(%)]

表2 TSCC中Survivin、E-cadherin、N-cadherin的表达与临床病理特征的关系[n(%)]

图8 Survivin、N-cadherin、E-cadherin在TSCC组织及癌旁正常组织中的表达

2.3 TSCC组织中Survivin与E-cadherin、N-cadherin表达的相关性TSCC组织中E-cadherin和N-cadherin的阳性率分别为42.9%和69.8%。相关性分析显示，Survivin与E-cadherin的表达呈负相关(r=-0.315，P=0.012)，与N-cadherin的表达呈正相关(r=0.474，P<0.001，表3)。

3 讨论

有研究表明，EMT是癌细胞获得侵袭和迁移能力的首要环节[3]。EMT是上皮细胞失去细胞极性和细胞黏附而获得间质特征的可逆过程，其中E-cadherin和N-cadherin是EMT的主要特征性蛋白。当细胞发生EMT时，表现为上皮性标志物的表达下调，如E-cadherin；而间质型标志物的表达上调，如N-cadherin[4]。因此，可通过检测E-cadherin和N-cadherin来鉴定EMT的发生。本组结果显示，E-cadherin在TSCC组织中表达明显低于癌旁正常组织，且随着肿瘤临床分期、病理分级越高，以及淋巴结转移的数目越多，E-cadherin在TSCC组织中的表达越低。N-cadherin在TSCC组织中的表达明显高于癌旁正常组织，且随着肿瘤临床分期、病理分级越高，以及淋巴结转移数目越多，N-cadherin在TSCC组织中的表达越高。

表3 TSCC中Survivin与E-cadherin、N-cadherin表达的相关性

Survivin在多数肿瘤中过表达，促进肿瘤的增殖和转移。Survivin作为节点蛋白，与参与有丝分裂、凋亡、功能整合增殖、细胞死亡和细胞内环境稳定的多种信号相互作用[5-6]。有研究发现[7-10]，Survivin与胃癌、乳腺癌、结肠癌、子宫颈癌等恶性肿瘤的转移有关。本实验结果表明，TNM分期越高则Survivin表达越高，病理分级越高则Survivin表达越高，有淋巴结转移者Survivin表达越高，提示Survivin表达增强可能对TSCC的侵袭和转移有重要的促进作用。

有研究表明[11-13]，Survivin对EMT有潜在的诱导作用，从而促进结肠癌及卵巢癌的转移。本组结果表明，在TSCC组织中Survivin的表达与E-cadherin呈负相关，与N-cadherin呈正相关，提示Survivin可能作为诱导EMT进程的诱因之一，参与多种信号通路(TGFb、ERK1/2、P13K/AKT)促进癌细胞EMT的发生[14]。本组仅在组织水平验证Survivin与EMT在TSCC组织中的表达水平及相关性分析，而Survivin是通过何种途径调控TSCC组织EMT的发生需更深入的探讨。