羊水样本卵磷脂和鞘磷脂检测超高效液相色谱串联质谱方法的建立及应用

曹 正， 刘京瑞， 谢 鑫， 刘一林， 董 莹， 唐国栋， 翟燕红

（1.首都医科大学附属北京妇产医院检验科，北京 100026；2.北京奥米科生物科技有限公司实验室，北京 100094）

新生儿呼吸窘迫综合征（respiratory distress syndrome，RDS）是由于胎肺未发育成熟，缺乏肺表面活性物质，出生后不久出现呼吸窘迫并进行性加重的临床综合征。有调查结果显示，因胎儿肺部不成熟而造成的新生儿死亡占新生儿总死亡数的70%左右[1]。胎儿呼吸系统是胎儿最晚发育成熟的系统之一，RDS的发病率与孕周呈负相关[2]。正常情况下，在胎肺发育的最后阶段（妊娠32周左右），肺表面活性物质的合成会逐渐增加，附着在肺泡上皮细胞的表面活性物质可以降低肺泡表面张力，增加肺的顺应性，减轻呼吸肌负担，从而防止新生儿肺不张[3]。RDS患儿由于表面活性物缺乏，会发生肺萎陷和肺泡过度扩张，甚至发生肺纤维化和肺透明膜病，与之伴随的还有组织缺氧和呼吸性酸中毒[4]。妊娠28周时，胎儿肺表面活性物质开始由肺泡Ⅱ型细胞合成，并储存于板层小体（lamellar body，LB）内，LB被分泌出细胞后存在于肺泡表面的液体中，伴随胎儿的呼吸运动被排到羊水中[5-6]。随着胎儿的发育，不同磷脂在LB中的比例会发生变化。因此，检测羊水中各种磷脂的含量可以有效预测胎肺成熟度。常用的预测胎肺成熟度的方法是分析羊水中肺表面活性物质的水平，如采用薄层层析色谱（thin layer chromatography，TLC）法检测羊水中卵磷脂和鞘磷脂水平并计算卵磷脂/鞘磷脂（lecithin/sphingomyelin，L/S）比值、采用板层小体计数（lamellar body count，LBC）法检测羊水中LB水平，但这些方法耗时、耗力且效率较低。

近年来，质谱被越来越多地应用于药物、类固醇、生物胺、氨基酸、有机酸、蛋白质和核糖体RNA等检测[7]，凭借其高目标物覆盖范围、检测时间短、定量准确等优势成为各类组学研究的热门工具[8]。由于卵磷脂、鞘磷脂属于脂类物质混合物，所以适合在高分辨质谱平台上同时进行半定量检测。为此，本研究拟建立超高效液相色谱串联质谱（ultraperformance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）快速检测羊水中卵磷脂和鞘磷脂水平的半定量方法。

1 材料和方法

1.1 研究对象

收集2018年1—12月首都医科大学附属北京妇产医院孕期筛查时进行羊水穿刺或分娩得到的羊水样本30份，-80 ℃保存。行羊水穿刺的孕妇孕周为孕18周，分娩时孕周为孕32～39周。胎肺成熟度判断以临床分娩记录中的新生儿Apgar评分为标准。

1.2 方法

1.2.1 仪器与试剂 去离子水、甲醇、乙腈、甲酸、异丙醇、甲基叔丁基醚购自美国Fisher Scientific公司，氯仿购自美国Mreda公司，乙酸铵购自美国Sigma-Aldrich公司。内标[神经酰胺（ceramide，Cer）+鞘磷脂（sphingomyelin，Sph）混合液、磷脂酰胆碱（phosphatidylcholine，PC）12：0-13：0、磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethoanolamine，P E）1 2：0-1 3：0、磷脂酰甘油（phosphatidylglycerol，PG）17：0-20：4]购自美国Avanti Polar Lipids公司。Dionex UltiMate 3000超高效液相色谱仪、Q Exactive四极杆轨道离子阱质谱仪、Savant SPD131DDA SpeedVac型真空离心浓缩仪均购自美国Thermo Fisher Scientific公司。ACQUITY UPLC BEH C8反向色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm；美国Waters公司）。Skyline定量分析软件（美国MacCoss公司）。Mix-3000型震荡混匀器购自杭州米欧仪器有限公司，Mikro 220R型台式高速冷冻离心机购自德国Hettich公司。

1.2.2 样本前处理 将羊水样本置于室温下的冰快中30～60 min，待样本融化。取40 μL血清置于1.5 mL离心管中，加入300 μL含内标（Cer、Sph、PC12：0-13：0、PE12：0-13：0、PG17：0-20：4）的甲醇溶液（1 mL混合内标，用甲醇稀释至6 0 m L），涡旋2 min，加入1 mL甲基叔丁基醚（methyl tertbutyl ether，MTBE） 溶剂，震摇提取1 h，加入250 μL去离子水，混匀。4 ℃条件下13 690×g离心10 min，取600 μL MTBE层溶液，用Savant SPD131DDA SpeedVac型真空离心浓缩仪挥干浓缩，加入100 μL异丙醇和乙腈（1∶1）混合液，震摇复溶，13 690×g离心10 min，取上层溶液置于250 μL内衬管中。

1.2.3 色谱条件 脂质的分离在Dionex UltiMate 3 0 0 0 超高效液相色谱仪上进行，色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C8反向色谱柱，流动相A为乙腈∶水=6∶4（含0.1%甲酸、5 mmol/L乙酸铵），流动相B为异丙醇∶乙腈=9∶1（含0.1%甲酸、5 mmol/L乙酸铵），流速为0.26 mL/min，进样量为1 μL，柱温为40℃。梯度洗脱：0 min（100%流动相A），2.0 min（70%流动相A、30%流动相B），12.0 min（30%流动相A、70%流动相B），12.5 min（5%流动相A、95%流动相B），13.0～14.0 min（100%流动相B）。14.1～16.0 min（100%流动相A）。

1.2.4 质谱条件 正离子电压为3.7 kV，负离子源电压为3.5 kV，毛细管加热温度为320 ℃，溶剂加热蒸发温度为300 ℃。鞘气：氮气，压力30 psi；辅助气：氮气，压力10 psi；碰撞气：氮气，1.5 mTorr。所有用于质谱分析的气体均为氮气。一级全扫描参数：分辨率为70 000，自动增益控制目标为1×106，最大隔离时间为50 ms，质荷比扫描范围为50～1 500。液质系统控制及数据采集均由Xcalibur 2.2 SP1.48软件（美国Thermo Fisher Scientific公司）完成。

1.2.5 数据处理 采集好的数据采用Skyline定量分析软件（美国MacCoss公司）处理。根据目标代谢物已知加合方式确定的精确相对分子质量和检测方法已确定的代谢物保留时间设置提取参数，使用分析模型对目标代谢物峰进行积分提取，根据已知内标浓度和内标峰面积定量计算脂质指标水平。卵磷脂总量为64种磷脂峰面积之和，鞘磷脂总量为23种磷脂峰面积之和。

1.2.6 质控 采用质控样本监测检测系统的稳定性和重复性。质控样本由所有样本移取固定体积并混匀后得到，其前处理方法和待测样本一致。首先采用5个空白样本平衡色谱柱，再采用3个质控样本平衡柱条件，检测时每间隔5个样本插入1个质控样本。

1.2.7 LB检测 采用XN-2000/3000全自动血液分析仪（日本SYSMEX公司）的血小板通道检测LB。

1.3 不同方法对胎肺成熟的判断标准

30份羊水样本中，有7份采集于孕18周，此时为胎肺极不成熟状态，因此作为基线对照；采集于孕妇分娩时的23份羊水样本中，有3份取自胎肺未成熟胎儿母体、20份取自胎肺成熟胎儿母体。根据文献报道，UPLC-MS/MS以L/S比值＜10为胎肺不成熟，L/S比值≥10为胎肺成熟[9]；LBC法以LB＜50×109/L为胎肺不成熟，LB≥50×109/L为胎肺成熟[10]。

1.4 统计学方法

采用SPSS 21.0软件进行统计分析，呈正态分布的数据以表示，各组间比较采用方差分析。计数资料以率表示，组间比较采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 UHPLC-MS/MS的性能

质控样本的总离子流图显示，离子峰强度和保留时间均在可检测范围内。见图1。

6个质控样本在电喷雾离子源（electrospray ionization，ESI）反相色谱正离子的非监督模式下，主成分分析（principal component analysis，PCA）显示聚类良好。本法重复性好、性能稳定、数据可靠。见图2。

图1 质控样本的总离子流图

图2 质控样本的PCA图

2.2 UPLC-MS/MS与LBC法的比较

与基线组比较，胎肺成熟组羊水L/S比值和LB水平均显著升高（P＜0.05），胎肺不成熟组羊水LB水平显著升高（P＜0.05），但羊水L/S比值与基线组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 各组羊水中L/S比值和LB水平的比较

采用UPLC-MS/MS检测羊水中的卵磷脂和鞘磷脂水平并计算L/S比值，L/S比值判断胎肺成熟度的敏感性和特异性均达到100%。LBC法对胎肺不成熟羊水样本有2例错判，对胎肺成熟样本有1例错判，敏感性和特异性分别为80%和95%。2种方法的敏感性和特异性差异均有统计学意义（P＜0.05）。

3 讨论

临床实践证明，对出生后可能患有RDS的早产儿产前注射糖皮质激素，可以促进肺表面活性物质的合成，使患儿尽早脱离机械通气，降低RDS的危害程度[11]。因此，为了降低早产儿RDS的发生率，临床上会对计划早产的孕妇在产前注射促胎肺成熟药物，如糖皮质激素等。但使用促肺成熟药物也可能会引起一些不良后果。有研究结果显示，胎儿在母体内接触糖皮质激素可能会对心血管、新陈代谢和神经内分泌功能造成长期损害，导致早产儿出生体质量下降、头围变小，并且与长期精神运动发育障碍有一定关联[12]。因此，有必要对胎儿及时进行胎肺成熟度预测，避免产前过度使用促肺成熟药物。

LB由90%的磷脂和10%的表面活性蛋白组成。由于LB的大小与血小板相近，所以可以用血液分析仪的血小板通道进行检测。尽管LBC法简便易行，但在实际操作中缺乏标准化的质控品，结果也易受血和胎粪污染的影响，而且LB判断胎肺成熟度的临界值也存在争议[13]。

1971年，L/S比值作为最早的评估胎肺成熟度的指标被报道，其与胎肺成熟度有良好的相关关系[14]。卵磷脂含量在孕35周前与鞘磷脂近乎相等，孕35周后其含量迅速增加，成为羊水中肺表面活性物质最主要的成分，鞘磷脂在羊水中的含量虽较低，但在整个晚孕期几乎不变，可作为卵磷脂的天然参照物[15]。因此在孕35周以前，肺泡表面活性物质中卵磷脂和鞘磷脂的比例近似相等，孕35周以后，L/S比值迅速升高。一般L/S比值＞2.0提示胎肺发育成熟[16]。但有研究结果显示，当孕妇患有糖尿病时，L/S比值＞2.0并不能准确、有效地判断出胎肺成熟度[17]。

TLC是一种检测羊水中L/S比值的手工色谱层析法，大致的步骤是：经过离心等前处理，用溶剂将羊水中的卵磷脂和鞘磷脂展开到薄层色谱板上，以2种磷脂带对照于标准带的相对密度来表示L/S比值。TLC法操作繁琐，耗时耗力，影响因素多，有些实验步骤甚至存在争议，难以标准化，实验室间的数据比对结果显示其精密度较差[18]，目前市场上无相应的试剂盒，因此已不再被应用于临床检测。

当前用质谱方法检测L/S比值的研究不多。有研究结果显示，液相色谱-串联质谱（liquid chromatography tandem mass spectrometry，LCMS/MS）检测L/S比值预测胎肺成熟度的临界值为10，基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption and ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）检测L/S比值预测胎肺成熟度的临界值为9，但由于样本中实际丰度的原因，研究者只能检测羊水样本中丰度较高的6种卵磷脂和1种鞘磷脂[9]。本研究建立的UPLC-MS/MS方法不仅具有大范围的筛选能力，而且可进行目标定量检测，分辨率更高，尤其适用于脂质类混合物的分析，其半定量结果来自于64种卵磷脂的丰度之和及23种鞘磷脂的丰度之和，提高了L/S比值的准确性。本法精密度良好，目标范围内的离子峰强度和保留时间均在可控范围内。在方法学比对中，本研究以新生儿Apgar评分作为判断胎肺是否成熟的标准，UPLC-MS/MS以L/S比值=10作为临界值[19]，LBC法以LB＝50×109/L作为临界值[10]。结果显示UPLC-MS/MS的敏感性和特异性均为100%，LBC法的灵感性和特异性分别为80%和95%。提示UPLC-MS/MS可用于预测胎肺成熟度。

本研究的局限性在于样本量较小。由于临床会提前进行促肺干预，因此实际能取得的阳性样本非常少。本研究取得的胎肺未成熟胎儿母体羊水样本仅有3份。考虑到孕18周的羊水相当于空白基线对照，为胎肺不成熟的极端情况，并且本研究的2种方法是定量或半定量检测，可以直接检出羊水中待测物的含量，因此可以与胎肺未成熟检测样本一同作为不成熟样本与成熟样本进行比对，评价2种检测方法的敏感性和特异性。本研究检测的磷脂种类数目与KWAK等[9]检测的数目有一定差异，因此虽然本研究使用了KWAK等[9]报道的L/S比值的临界值，但该临界值是否适用于本研究建立的UPLCMS/MS方法还有待后续大规模样本的验证。

综上所述，UPLC-MS/MS在一定程度上可取代传统方法来检测羊水中的L/S比值，用于胎肺成熟度的预测，可在预防新生儿发生RDS的同时，降低过度用药对孕妇和胎儿造成的负面影响。