人结肠直肠癌组织中侧群细胞分选、鉴定及其化疗耐药特性的初步研究

刘贵远,周海华,2,张超逸,徐 洁

(1.江苏省泰州市人民医院,江苏 泰州,225300;2.扬州大学医学院,江苏 扬州,225001)

结肠直肠癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，其发病率及死亡率呈逐年增高趋势[1]。1959 年,Makino[2]正式提出了肿瘤干细胞(CSCs)的概念。肿瘤干细胞是一类具备高度增殖能力、自我更新、多分化潜能、数量很少的细胞群。肿瘤干细胞概念的提出为肿瘤的治疗提供了新的方向。相关研究[3]发现，结肠直肠肿瘤干细胞对肿瘤的复发和转移具有重要影响。本研究根据侧群(SP)细胞外排Hoechst 33342的特性，利用流式细胞仪从人结肠直肠癌组织中分选出SP,通过比较SP与非侧群(NSP)细胞耐药性、致瘤性的生物学特性，验证SP细胞的干细胞特性，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器

高糖DMEM培养液、胎牛血清、0.25% trypsin-edta、牛血清白蛋白(BSA)、表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、白血病抑制因子(LIF)、SITE、BD胶、B-27、Hochest33342、碘化丙啶均购自美国Sigma公司，水溶性四唑盐试剂(WST-1)购自罗氏公司；无血清培养基(SFM)配方成分包括bFGF 10.0 ng/mL,EGF 20.0 ng/mL,BSA 4.0 mg/mL,HEPES 5.0 mmol/L,L-G 2.0 mmol/L,B27比例1∶50,胰岛素(insulin) 10.0 mg/L,转铁蛋白(transferrin) 5.5 mg/L,硒(selenium) 5.0 mg/L,乙醇胺(ethanolamine) 2.0 mg/L;FACS Diva流式细胞仪(BD公司)。

1.2 实验动物

8周龄非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷(NPD/SCID)裸鼠20只，体质量16.0～20.0 g,均为雄性，由上海中国科学院实验动物中心提供。

1.3 方法

1.3.1 结肠直肠癌细胞的提取:新鲜人结肠直肠癌组织(取自手术切除结肠直肠癌的新鲜癌组织9例，并获得患者及其家属知情同意)1 cm× 1 cm× 1 cm,具体标本情况见表1。采用含青霉素500.0 U/mL、链霉素500.0 μg/mL、两性霉素B 2.0 μg/mL的冷生理盐水反复冲洗;无菌剪刀将人结肠直肠癌组织剪成约2 mm3的组织块，用含1.5 mg/mL胶原酶Ⅲ、100.0 U/mL脱氧核糖核酸酶I及20.0 μg/mL透明质酸酶的无血清DMEM培养基，于37 ℃恒温水浴箱内消化;终止消化，吸管充分吹打组织后重悬细胞,70.0 μm细胞筛网过滤后，40.0 μm细胞筛网再过滤，收集细胞悬液,1 000转/min离心5 min,弃去上清液;按1∶(3～5)的比例加入红细胞裂解液，轻轻吹打混匀;冰浴中静置5 min;上述细胞悬液1 000转/min离心5 min，离心弃去上层红色清液;加入PBS离心漂洗2次,2%胎牛血清培养基培养、分离、提取的细胞。

表1 新鲜人结肠直肠癌组织标本情况

1.3.2 SP细胞的流式细胞仪分选:收集对数期的结肠直肠癌细胞，制成1×106/mL单细胞悬液。研究设计分为对照组、实验组，对照组中加入50.0 μmol/mL维拉帕米，2组分别加入终浓度为5.0 μg/mL的Hoechst33342,37 ℃水浴90 min,15 min 摇匀1次，冰上5 min 终止反应;PBS冲洗，重悬于预冷的含2%胎牛血清的培养基中，加入PI至终浓度2.0 μg/mL,去除死细胞，用FACS流式细胞仪分选SP细胞与NSP细胞，分别接种于三维培养基中。

1.3.3 三维(TD)培养小室的构建及SP细胞的培养:采用规格为(35.0 mm×10.0 mm)的培养皿，底部涂以3.0 mL BD胶，厚度为2.0 mm,构建TD培养小室，将分选的SP细胞与NSP细胞接种于3-D培养小室，并加入3.0 mL SFM,每3 d更换1次培养基。

1.3.4 体内致瘤能力分析:将分选的SP细胞和NSP 细胞用无血清培养基制成单细胞悬液，分为103、104、105、106共4 组，每组5只裸鼠，分别与BD Matrigel以1∶1的比例混合，注入裸鼠的左右腹侧腋下缘皮下，右侧注入SP细胞,NSP 细胞作为对照，注入同一只裸鼠左侧相应部位的皮下，裸鼠饲养于SPF级动物实验室,1个月后处死裸鼠，计算成瘤率。

1.3.5 无血清成球实验:流式分选的SP细胞和NSP 细胞，分别置于SFM,制成浓度为5×106/mL单细胞悬液，分别接种于超低吸附的6孔板内,37 ℃、5% CO2环境下孵育，每2～3 d更换SFM,每天同一时间置于显微镜下观察细胞形态及成球情况。

1.3.6 耐药实验:将SP细胞和NSP 细胞用0.25%胰酶消化，离心弃去上清后,SFM重悬细胞并计数，调整细胞浓度为1×106/mL,每孔100.0 μL接种于96孔板，第1列为对照组，第2～5列为实验组，每次设4个复测孔，置于37 ℃、5% CO2环境下孵育48 h,之后每孔加入5-氟尿嘧啶 (5-FU、50.0 mg/mL) 100.0 μL,同样的环境继续孵育，分别于24、48、72、96 h,加入10.0 μL细胞增殖试剂WST-1,按照说明书操作。采用酶标分析仪，以波长为490 nm测量每个孔的吸光度值(OD值)，取4个OD值的平均值为最终OD值，采用公式计算5-FU对SP细胞和NSP 细胞抑制率。抑制率(IR)=(1-药物OD值/对照组OD值)×100%,IR≥30%说明耐药实验阳性，反之为耐药实验阴性。

1.4 统计学方法

采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析，组间数据比较采用t检验及方差分析;P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 人结肠直肠癌组织中SP细胞的流式细胞仪检测和分选

采用FACS 检测到结肠直肠癌组织中存在SP细胞亚群，其所占比例为(0.90±0.10)%,见图1、2。SP细胞在三维培养基中培养的结果见图3。

A:加入Hochest的SP分选流式图;B:加入Hochest和verapamil的对照流式图。

图1 流式细胞仪检测人结肠直肠癌细胞SP细胞的流式图

2.2 SP与NSP 细胞裸鼠成瘤能力的比较

在103、104、105、106个SP细胞接种裸鼠皮下时，其成瘤率分别为30.0%、50.0%、70.0%、100.0%,而NSP细胞的成瘤率分别为0%、0%、40.0%、60.0%,差异有统计学意义(P<0.05)。

2.3 SP细胞与NSP细胞无血清培养基中成球能力的比较

肿瘤干细胞的活性通过体外无血清基中成球实验检测，作者发现SP细胞在培养的第2天就有似葡萄状细胞团形成，细胞团内部细胞排列松散，团与团之间通过少量的细胞连接，随着培养时间的推移，细胞团内部细胞排列越来越紧密，细胞团之间互相孤立;第6天初见细胞球的轮廓，第8天球的外形越来越明显，第10天完全成球状。NSP细胞在培养的第2、4天无太大变化;随后几天，细胞出现死亡，数量越来越少，直至最后，细胞几乎全部死亡。见图4。

2.4 耐药实验

5-FU与SP细胞、NSP 细胞共培养后，作者分别检测24、48、72、96 h的OD值，发现SP细胞与NSP 细胞对5-FU的耐药有差异,SP细胞、NSP 细胞的抑制率分别为17.4%、54.8%,差异有统计学意义(P<0.05),见图5。

3 讨 论

本实验中，作者从新鲜的人结肠直肠癌组织中分选出SP细胞，通过体内及体外实验，发现SP细胞具有肿瘤干细胞的特性，如增殖、自我更新、耐药及抗凋亡等。作者观察了SP与NSP细胞在细胞增殖、抗凋亡、肿瘤形成能力方面的差异，这些实验结果与相关研究[4-7]结果相符合。

目前，肿瘤干细胞的分选主要借助2种途径，即流式细胞仪(表型标记筛选法、SP细胞筛选法)和磁性细胞分选仪[8]。表型标记筛选法与磁性细胞分选仪都是通过特异性分子标记物，而SP细胞筛选法则是通过SP细胞外排Hoechst染料而成低染的功能特性筛选干细胞。目前通过分子标志物CD44、CD133、CD166等分选的结肠直肠癌干细胞的干性还有待进一步研究[9]。在缺失精确肿瘤干细胞标志的情况下,SP表型可以被作为肿瘤干细胞的标志[10]。在这种情况下，作者利用SP细胞的功能特性，从人结肠直肠癌组织中分选肿瘤干样细胞，进而研究结肠直肠癌干细胞的相关特性。本实验利用Hoechst 33342染色人结肠直肠癌细胞，采用流式细胞仪检测出SP细胞比例约(0.9±0.10)%,较之前研究的结果偏高(0.3%～0.7 %)[11]。分析原因认为，之前的研究都是基于细胞株，本实验采用的细胞是从新鲜的离体组织中获得，同时还受单细胞悬液的制备、细胞计数、Hoechst质量浓度、Hoechst 33342染色时间等影响。

体内裸鼠成瘤实验是鉴定肿瘤干细胞的有效方法。本实验发现103个SP细胞就可以导致裸鼠成瘤，而NSP细胞所需要最低的细胞数目为105个。由此可知,SP细胞较NSP有更强的致裸鼠成瘤能力(P<0.05)。Ricci-Vitiani等[12]采用了含EGF、bFGF的无血清培养基研究结肠癌干细胞时发现，大部分已分化的结肠癌细胞不能在无血清培养基中生存，仅有少量未分化的结肠癌细胞可以形成富含肿瘤干细胞的细胞球，并能在无血清培养基中存活。本实验体外培养SP细胞时采用无血清培养基及细胞外基质胶的TD培养，模拟肿瘤干细胞体内生存环境[13];无血清培养基中加入了EGF、bFGF、LIF、B27等细胞因子，其中 B27可以代替血清满足细胞生长的需要，同时也排除了血清中分化刺激因子;LIF能够保持干细胞未分化的状态[14]。SP细胞能在无血清培养基中以细胞球的形式存在，而NSP细胞在无血清培养基中则无法生存。研究[15]揭示肿瘤干细胞是肿瘤复发的根源，并且对传统的化疗药物不敏感成为化疗失败原因之一。本实验中，作者将5-FU分别与SP细胞、NSP细胞共培养，发现5-FU对SP细胞的抑制率较NSP细胞显著更低,SP细胞比NSP细胞更具有耐药性，这也可能解释目前恶性肿瘤经放化疗后仍然会出现复发、转移等问题[10,16]。

综上所述，作者从离体的新鲜的人结肠直肠癌组织中检测到SP细胞，并通过实验验证了SP细胞的干性(致瘤性、耐药性)，进一步阐明了肿瘤干细胞能够在恶劣环境下(化疗)存活，为抗肿瘤治疗提供新的方向。