不同穴位艾灸对腹泻模型小鼠腹泻指数及小肠AQP8、VIP及SP表达的影响

杨晓希，武小利，高 纺，吴生兵，周美启

(1.安徽中医药大学研究生院，安徽 合肥 230012；2.安徽中医药大学 新安医学教育部重点实验室，安徽 合肥 230038；3.安徽省中医药科学院亳州中医药研究所，安徽 亳州 236800)

腹泻是指日排便超过3次且每日排便量大于200 g，粪便内含水量高于85%[1]。功能性腹泻是腹泻的一种，是较为常见的消化道疾病，其发病一般无器质性损害，多数原因可能与患者饮食习惯、生活起居以及个人体质因素相关，因此其发病率一直居高不下。目前，随着艾灸在临床上的广泛使用，艾灸治疗功能性腹泻的疗效也十分显著，并逐渐得到大众的认可[2-5]。因此，艾灸治疗腹泻也成为目前的研究热点[6]。研究[7]表明，针灸治疗功能性肠病是通过神经-免疫网络调控途径发挥作用，但艾灸干预功能性腹泻是否通过调节血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide，VIP)、P物质(substance P，SP)和水通道蛋白8(aquaporin protein-8，AQP8)表达而实现的暂不得而知。本研究在前期研究[8]基础上，观察艾灸对腹泻模型小鼠腹泻指数及小肠组织VIP、SP、AQP8表达的影响，探讨艾灸干预腹泻的作用机制，为艾灸临床应用提供参考。

1 材料

1.1 动物及分组 选取健康、清洁级昆明小鼠90只，雄性，体质量为20～30 g，由安徽省实验动物中心提供，生产许可证号：SCXK(皖)2011-0002。独立送风隔离笼具饲养，室内温度控制在(22±1)℃的范围内，相对湿度(55±5)%，自然光照，小鼠自取食水。室温适应环境下饲养1周后，按照随机数字表法，从90只小鼠中选取15只作为正常组，其余75只进行腹泻模型的复制，将模型复制成功的小鼠随机分为天枢组、大肠俞组、天枢大肠俞组和模型组，每组16只。模型复制不成功的以及实验中死亡小鼠均未列入实验分析对象。

1.2 药品与试剂 番泻叶：合肥百姓缘大药房；中性甲醛、乙醇、二甲苯：上海化学试剂公司；AQP8、VIP、SP抗体及通用型二步法二抗、DAB显色试剂盒：北京中杉金桥生物技术有限公司；其余实验所需试剂为国产分析纯，由安徽中医药大学新安医学教育部重点实验室配制。

1.3 仪器与设备 TB718包埋机：湖北泰维；Leica2135切片机：德国莱卡；Olympus BX51显微镜：日本奥林巴斯)；JD801显微图像分析系统：南京捷达。

2 方法

2.1 模型制备与评定

2.1.1 番泻叶煎剂的制作 参考高蕊等[9]的报道，取番泻叶加水煮沸约10 min，双层纱布过滤，滤液减压浓缩成1 g/mL的番泻叶煎剂，冰箱保存，用时水浴加温至25 ℃。

2.1.2 模型复制 参照周干南等[10]报道的小鼠腹泻模型的制备方法：实验室饲养2 d的健康小鼠，每日灌服番泻叶煎剂0.5 mL，连续3 d(每日9:00灌胃，11:00—16:00每隔1 h更换滤纸，记录1次，共5次)。每日灌胃后将小鼠单独分开放入垫有滤纸的鼠笼饲养，于模型复制前将小鼠禁食10 h，自由饮水。

2.1.3 模型复制成功标准 模型复制后5 h内，观察有粪便不成形者或稀便且滤纸上有污迹者，即视为模型复制成功。

2.2 治疗方法

2.2.1 腧穴定位 “天枢”“大肠俞”腧穴定位参照常用实验动物针灸穴位的取穴标准[11]。

2.2.2 艾灸方法 天枢组取双侧天枢穴，大肠俞组取双侧大肠俞穴，天枢大肠俞组取同一侧天枢、大肠俞(隔日交换对侧)，固定，采用直径为0.7 cm、长为10 cm的清艾条悬于相应穴位上方2 cm处，温和灸20 min，每日1次，7 d为1个疗程；正常组、模型组不予艾灸。

2.3 观察指标及检测方法

2.3.1 腹泻指数 模型复制结束后，把每只小鼠分别单独放入鼠笼饲养，每只鼠笼内皆备有一层滤纸且每小时更换1次滤纸，并记录5 h内小鼠排稀便的情况，计算腹泻指数，并进行组间比较。腹泻指数计算参考相关报道[12]：腹泻指数=稀便率(每只小鼠所排稀粪数/总便数)×稀便级(以稀便污染滤纸形成污迹面积分级，分为4级。1级：污染直径<1 cm；2级：1 cm≤污染直径<2 cm；3级：2 cm≤污染直径≤3 cm；4级：污染直径>3 cm)，分开统计每一堆稀便的级数(稀便级=单只小鼠所有稀便级数总和/稀便总次数)；级数直径的测量：呈圆形的粪便直接测量直径，呈椭圆形的粪便直径取其最长和近似圆直径的平均值；区分干便与稀便标准：以滤纸上有无污迹为主；粪便次数的统计：以每粒或每堆(不能分清粒数者)为1次。

2.3.2 AQP8、VIP及SP免疫阳性细胞表达 小鼠腹泻指数统计完成后，选取正常组、模型组及疗效最好的艾灸组用于免疫组织化学检测；各组分别取8只小鼠脱颈椎处死，开腹取出小肠，截取长1 cm小肠放入4%中性甲醛中固定24 h，脱水，石蜡包埋、切片。参考试剂说明书进行对应染色。免疫组织化学染色后，胞膜、胞核或胞浆有棕黄色颗粒为阳性细胞。AQP8、VIP及SP免疫阳性细胞表达水平采用JD形态分析系统分别计算其吸光度值。

3 结果

3.1 各组小鼠腹泻指数比较 与正常组比较，模型组腹泻指数显著增高(P<0.05)；与模型组比较，天枢组、大肠俞组、天枢大肠俞组腹泻指数均显著降低(P<0.05)；与大肠俞组、天枢组比较，天枢大肠俞组腹泻指数显著降低(P<0.05)。见表1。

表1 各组小数腹泻指数比较

注：与模型组比较，#P<0.05；与天枢大肠俞组比较，△P<0.05

3.2 各组小鼠AQP8、VIP及SP免疫阳性细胞表达水平比较 与正常组比较，模型组小肠组织AQP8免疫阳性细胞表达水平显著减少(P<0.05)，VIP、SP免疫阳性细胞表达水平显著增加(P<0.05)；与模型组比较，天枢大肠俞组小肠组织AQP8免疫阳性细胞表达水平显著增加(P<0.05)，VIP、SP免疫阳性细胞表达水平显著减少(P<0.05)。见表2、图1。

表2 各组小鼠AQP8、VIP及SP表达水平比较

注：与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

4 讨论

腹泻是由于肠道对水分的吸收功能减弱或者分泌功能增强而导致大便粪质含水量增加所致的一种肠道疾病[13]，属中医学“泄泻”范畴，其基本病机为脾病湿盛，脾胃运化功能失调，肠道功能失司[14]。

天枢穴属胃经，亦为大肠之募穴，主治腹胀肠鸣、便秘、泄泻等疾病[15]54。大肠俞为大肠之背俞穴，《千金方》云：“大肠俞主暴泄”，即大肠俞具有理气通腑、调和胃肠的功效。现代研究[16]发现，艾灸天枢穴可以降低腹泻型肠易激综合征小鼠的血清炎症因子水平，可用于治疗腹泻。

图1 各组小鼠AQP8、VIP及SP免疫阳性细胞表达(免疫组织化学染色法，10×40倍)

俞募配穴是指同一脏腑的背俞穴和募穴配合使用的一种配穴方法，也称前后配穴法[15]34。天枢穴配大肠俞为常见的治疗肠腑疾病的俞募配穴法。俞募配穴旨在发挥协同作用，达到更好的治疗效果，体现了中医学“从阴引阳，从阳引阴”的思想，因“气在胸者，止之膺与背俞。气在腹者，止之背俞……”(《灵枢·卫气》)，即脏腑之气与其俞、募穴密切相关，二者结合可发挥协同作用。现代研究[17]认为，同时刺激天枢、大肠俞可以调理肠胃，改善肠道功能。

AQP8是一种分布于动植物组织器官中，在转运跨细胞水、分泌吸收液体中起着重要作用的水通道蛋白[18]。水通道蛋白参与了消化道水分的分泌和吸收，AQP8表达异常则会引起腹泻[19]。因此，通过检测腹泻模型小鼠小肠组织AQP8免疫细胞表达水平，可以反映艾灸干预腹泻过程中对AQP的调节作用及其机制。VIP多存在于胃肠道黏膜的内分泌细胞、黏膜下的细微神经纤维以及肠肌神经丛等[20]。生理情况下，VIP具有胃肠激素作用和神经肽的双重功能， 促进肠道水、电解质、胰液及肠液的分泌, 调节胃肠吸收，还具有抗炎作用[21]。SP在肠道中含量较丰富，可兴奋平滑肌、舒张血管和促进腺体分泌等，参与感觉信息传递、胃肠活动、痛觉调制、心血管活动、神经内分泌等复杂的生理功能[22]。

本研究表明，艾灸不同腧穴可显著降低腹泻模型小鼠的腹泻指数，且天枢大肠俞组效果最佳，说明天枢与大肠俞配伍治疗腹泻具有协同效应；免疫组织化学染色结果显示，与模型组比较，天枢大肠俞组小肠组织AQP8免疫阳性细胞表达显著增加(P<0.05)，VIP、SP免疫阳性细胞表达均显著减少(P<0.05)，小肠组织AQP8表达上调可增强肠道水分吸收，改善粪质性状，而VIP、SP的增加可刺激肠道蠕动，增加排便次数，对VIP、SP免疫阳性细胞表达的抑制可缓解胃肠道的不适，减轻腹泻[23-24]。艾灸不同腧穴治疗腹泻的机制可能与上调AQP8表达或下调VIP、SP表达有关。