籼粳遗传背景对水稻淀粉特性的影响

陶士博,李鸣晓,徐 铨

（1 辽宁省重要技术创新与研发基地建设工程中心，沈阳 110168；2 沈阳农业大学 水稻研究所，沈阳 110866）

水稻为全球超过50%的人口提供主食，是最重要的粮食作物之一（万建民，2010）。随着长期的驯化过程，水稻分化形成了不同的亚种，粳稻 （O.sativa ssp.japonica） 和籼稻 （O.sativa ssp.indica）［1－5］。 籼粳亚种在生物学特性上存在显著差异，尤其是两个亚种在水稻品质性状上的差异尤为显著。随着人们生活水平的提高，水稻品质的提高也逐渐成了育种家和生物学家的目标， 籼粳之间的品质差异也成了研究的重中之重。 Nakamura Yasunori（2017）对水稻淀粉基因进行了全面的分析［6］，我们选择几个重要的淀粉合成酶进行分析：水稻的蜡质基因（Wx）位于第6 染色体，其淀粉合成酶为存在籼粳特异性及突变型waxy （gbss1），且仅存在于水稻的支链淀粉中， 含有该基因的水稻外观表现为纯白色［7－9］；SBE3 基因位于第 2 染色体且存在籼粳特异性， 其支链淀粉链长分布在6～13 范围内， 有利于该淀粉合成酶的合成，在17～34 和大于39 范围内，不利于该淀粉合成酶的合成， 含有该酶的水稻重量下降且稻米外观品质存在垩白现象［10］；FLO5 位于第 8 染色体，存在突变型，其基因型为 ss3a （e1）或者 floury－5，其支链淀粉链长分布在10～15 范围内， 有利于该淀粉合成酶的合成，在6～9 和30～60 范围内，不利于该淀粉合成酶的合成，外观品质存在白核现象，且该酶的存在可以使 SSI 、GBSSI、AGPase 水平上升［11，12］； 另一重要的淀粉合成酶 UGP1 位于第 9 染色体，在外观品质存在垩白现象，且可能雄性不育［13］。 为了进一步研究籼粳之间遗传差异对水稻淀粉的影响，本文以重组自交系群体（RILs）为试验材料，结合高通量测序，分析遗传因素对水稻淀粉特性的影响， 同时也分析本文涉及的淀粉合成酶基因型， 并分别探究淀粉特性及籼型位点频率（Fi）与品质性状的相关性，加深对水稻淀粉的研究机理，从而选育出更适合人民需求的水稻品种，提供了遗传学依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验选取了典型粳稻品种沈农265（SN265）与典型籼稻品种沪恢99（R99）杂交构建的重组自交系，重组自交系使用一粒传法构建，自交10 代后得到155 个株系。 其中， 粳稻品种沈农 265（SN265）作为“中国超级稻育种”项目实施以来育成的第一个粳型超级稻品种，具有直立穗、穗短及抗逆性强的特点， 尤其是在稻瘟病的抗性表现上极为显著（陈温福，2004）。籼稻品种泸恢 99（R99）作为籼稻的重要恢复系，具有弯曲穗、穗长的形态特点。 重组自交系和亲本种植于四川省农业科学院水稻研究所德阳育种基地（N32°， E104°）。 155个株系按随机区组试验排列，每个株系种植3 行，每行种植 10 株， 栽植规格均为行距 30.0 cm，株距为 13.3 cm，并设 2 次重复。 栽培方法如下：在播种前分别测定了各地的土壤自然肥力， 按基础肥力施用统一标准为每公顷150 kgN， 150 kgP，150 kgK 进行补施，并在移栽7 d 后施用返青肥，返青肥施用量为每公顷75 kgN。

1.2 水稻淀粉特性测定方法及数据分析

成熟期每个株系去除边株后，取中间的20 株的稻穗，单独进行脱粒。 稻谷脱粒后，在室温环境下自然风干保存三个月后， 通过精米机将所收获的稻谷碾磨成精米，将精米放入Foss 旋风磨中打粉，通过100 目筛子筛选，取精细米粉试样留取备用。运用Nakamura 全波段紫外分光光度计法测定链长分布，使用日立（Hitachi）U3900 紫外分光光度计进行200～900 nm 波长下进行扫描。 每个株系的淀粉特性测定重复两次。

1.3 籼型位点频率（Fi）的划分

籼型位点频率，又称Fi，我们定义亲本粳稻品种沈农265（SN265）的籼型位点频率为0，亲本籼稻品种沪恢99（R99）的籼型位点频率为1，试验材料的籼型位点频率指的是水稻株系偏向于籼稻亲本即R99 的频率， 筛选亲本间有多态性、均匀分布12 条染色体的籼粳特异SNP 标记， 计算每个株系整个染色体组籼粳成分比例， 进而求得每个株系的籼型位点频率， 从而更好地分析出其籼粳属性与水稻淀粉特性间的关系， 对于籼型位点频率 （Fi） 的具体划分， 我们将籼型位点频率（Fi） 小于 0.4 的划分为偏粳型，0.4 到 0.6 为中间型，0.6 以上的为偏籼型。

1.4 QTL分析

QTL 区间作图的方法最早提出于1989 年（Lander ES et al，1989），随后王建康（2009）提出了大麦品种更为全面的数量性状基因的完备区间的作图方法， 对于水稻淀粉特性的QTL 分析，同样适用，我们采用这种方法进行QTL 定位。 LOD阀值设为2.50 （不同环境下同时检测到时LOD＞2.40），当实际求得的 LOD 值大于 LOD 阀值时，就认为该区段存在1 个QTL，同时估算每个QTL 的加性效应值和贡献率大小。

1.5 淀粉合成基因型分析

采用的是全基因重测序技术，对四个地区，每个地区155 个株系， 分析过程为先对已知的水稻基因组序列进行不同个体的基因组测序， 并在此基础上， 对本次试验材料个体或群体进行差异性分析。

1.6 数据处理

使用Microsoft Excel 2010 软件处理数据和绘制图表， 使用 SPSS 23.0 软件统计分析。 四个地区的所有的样品都测两次重复， 数据结果使用2016 年的试验数据用于下面的分析。

2 结果与分析

2.1 籼型位点频率（Fi）与水稻淀粉特性的关系

我们将重组自交系群体通过籼粳特异 SNP标记得到的籼型位点频率结果列于图1。 由图可知： 由于籼型位点频率划分界限导致部分株系早分界线处出现重叠，但我们可以看到，超过60%的株系处于中间型， 偏粳型的株系数略大于偏籼型的株系数。 由于籼型位点频率（Fi）与淀粉特性之间相关性并不显著， 于是我们进一步将不同地区按各自生态环境下， 用图1 所列出的三种类型偏籼型、中间型、偏粳型作为SPSS 软件多因素方差分析中的固定因子， 用淀粉特性的四个指标AAC、Fa、Fb3、RS 作为因变量（表1）。 结果表明籼型血缘并不显著影响淀粉特性。

表1 籼粳类型间淀粉特性的差异

2.2 淀粉特性的QTL分析

我们依据水稻淀粉特性的四个指标AAC、Fa、Fb3及 RS 进行 QTL 定位， 得到以下数据 （表2），结果表明：对表观直链淀粉（AAC）进行 QTL定位， 我们共找到2 个表观直链淀粉 （AAC）的QTL， 位于第 1、7 染色体上，LOD 值介于 2.60～4.28， 加性效应值为－0.84～0.72， 单个贡献率为11.58～15.55；对短支链淀粉（Fa）进行 QTL 定位，我们共找到1 个短支链淀粉（Fa）的QTL，位于第7 染 色体 上，LOD 值介于 2.92， 加性效应值为0.25，单个贡献率为 7.70；对长分支支链淀粉（Fb3）进行QTL 定位，我们共找到5 个长分支支链淀粉（Fb3）的 QTL，位于第 1、3、4、5、6 染色体上，LOD值介于 3.43～41.11， 加性效应值为－1.25～1.45，单个贡献率为 0.96～22.23； 对抗性淀粉 （RS） 进行QTL 定位， 我们共找到 2 个抗性淀粉 （RS）的QTL， 位于第 1、6、7 染色体上，LOD 值介于 2.80～3.23， 加性效应值为－0.19～0.15， 单个贡献率为6.39%－12.68%。 第 1 染色体上的 2 位点能在表观直链淀粉（AAC）、长分支支链淀粉（Fb3）、抗性淀粉（RS）都被检测到，贡献率在 1.69%～15.55%，加性效应为0.15～0.72，该位点可能是一个稳定表达的 QTL 区域（Block1835—Block1841），控制着表观直链淀粉（AAC）、长分支支链淀粉（Fb3）、抗性淀粉（RS）含量；四川地区位于6 染色体上的62位点能在短支链淀粉（Fa）、长分支支链淀粉（Fb3）被检测到， 贡献率在 0.96%～7.70%， 加性效应为－0.30～0.25，该位点可能是一个稳定表达的QTL区域（Block13997—Block13994），控制着短支链淀粉（Fa）、长分支支链淀粉（Fb3）含量。

表2 淀粉特性的QTL 定位

2.3 淀粉合成相关酶的基因型分析

涉及水稻淀粉合成过程中的目标同工酶或调节因子共计28 个， 将这28 个淀粉合成过程中的目标同工酶或调节因子在本试验中进行分析 （表3），结果表明在28 个涉及到水稻淀粉合成过程中的酶中，只有三个基因在双亲之间存在差异，它们分别是 SBE3、SSIIIa、UGP1，分别位于试验材料的第2、8、9 染色体上。 针对于这三个淀粉合成相关酶的基因型， 我们将事先通过基因重测序得到的三个基因型的籼粳属性以亲本籼稻品种沪恢99（R99）和粳稻品种沈农 265（SN265）的淀粉特性为基准， 将除亲本外的其他所有株系的淀粉特性同样按照籼稻品种沪恢99（R99）淀粉特性接近、与粳稻品种沈农265（SN265）的淀粉特性接近以及与两者都不接近的杂合型分为偏籼型Preindica、偏粳型 Pre－japonica、中间型 Intermediate，从而得到三种淀粉合成相关酶基因型籼粳属性频次分布图（如图2）。 结果表明：对于SBE3 基因型来说，偏粳型＞偏籼型＞中间型，SSIIIa 基因型偏籼型＞偏粳型＞中间型，UGP1 基因型偏粳型＞偏籼型＞中间型。为了更加深层次的研究在上述三种籼粳属性下的三个淀粉基因型与水稻淀粉特性之间的关系， 我们将SPSS 22.0 处理下的多因素方差分析表汇总到表4。 结果表明：三个淀粉基因型与水稻淀粉特性之间均表现出极显著的差异性，接下来单独分析每个淀粉基因型， 我们发现SBE3基因型下， 不同籼粳属性的株系与AAC、Fa、Fb3、RS 未达到显著水平；SSIIIa 基因型下， 中间型的AAC 含量显著高于偏籼型和偏粳型株系，中间型的Fa 含量显著低于偏籼型和偏粳型株系，中间型的Fb3含量略高于偏籼型株系， 显著高于偏粳型株系；UGP1 基因型下， 不同籼粳属性的株系与AAC、Fa、Fb3、RS 未达到显著水平。

表3 淀粉合成相关酶的基因型

表4 不同淀粉基因型与淀粉特性差异性分析

3 讨论

作为水稻精米胚乳中最主要的成分， 淀粉的研究日益深入。但目前来说，对于淀粉的研究多以不同生态环境背景或针对某一特定的淀粉基因型进行研究， 而涉及到水稻籼粳属性与淀粉特性之间相关性的研究，目前还无相关研究。 我们发现，籼型频率（Fi）与水稻淀粉特性之间的相关性虽有着一定的趋势， 但其相关性并不显著。 李修平等（2014）通过元分析的方法进一步分析了水稻直链淀粉含量的 QTL 及其连锁图谱标记［14］， 孙春龙（2013）研究发现水稻抗性淀粉受基因加性效应控制，已知的蜡质基因（Wx）QTL 定位在水稻第6 染色体上［15］。为了更好的了解水稻淀粉特性，我们进行QTL 分析，发现位于第1 染色体上的2 位点能在表观直链淀粉（AAC）、长分支支链淀粉（Fb3）、抗性淀粉 （RS） 都被检测到， 贡献率在 1.69%～15.55%，加性效应为 0.15～0.72，该位点可能是一个 稳 定 表 达 的 QTL 区 域 （Block1835—Block1841）， 控制着四川地区的表观直链淀粉（AAC）、长分支支链淀粉（Fb3）、抗性淀粉（RS）含量。 Chen M H et al（2008）认为在水稻淀粉特性中，表观直链淀粉（AAC）是一个复杂的特征，受多种基因和环境的影响， 而最主要就是蜡质基因Wx［16］。 Wx 基因编码颗粒结合的是淀粉合成酶 I（GBSSI），从而催化表观直链淀粉（AAC）的合成。导致表观直链淀粉（AAC）改变可能受到蜡质基因（Wx） 的表达的影响［17，18］。 除了淀粉特性中的AAC 外，其他淀粉特性指标 Fa、Fb3、RS 与淀粉合成酶之间的关系还有待进一步研究。 关于水稻淀粉基因型的分析，我们从28 个与淀粉合成过程中相关的淀粉合成酶进行筛选符合条件的三个重要淀粉合成酶基因SBE3、SSIIIa、UGP1 进行分析。其中SBE3、、UGP1 都表现出偏粳型株系略大于偏籼型，SSIIIa 表现出偏籼型略大于偏粳型，中间型表现不明显。在此基础上，我们更加需要了解在该分类下， 三种淀粉基因型与淀粉特性之间的差异性，结果显示：三个淀粉基因型以亲本淀粉特性为依据下， 与水稻淀粉特性之间均表现出极显著的差异性，其中SBE3、UGP1 淀粉基因型，不同籼粳属性的株系与 AAC、Fa、Fb3、RS 未达到显著水平；SSIIIa 基因型， 中间型的AAC 含量显著高于偏籼型和偏粳型株系，中间型的Fa 含量显著低于偏籼型和偏粳型株系， 中间型的Fb3含量略高于偏籼型株系，显著高于偏粳型株系，AAC、Fb3含量变化趋势一致，与Fa 含量变化趋势相反，再次印证了淀粉特性指标间的关系。 位于第8 号染色体上的SSIIIa 淀粉合成酶基因型对试验材料中杂合型株系表观直链淀粉 （AAC）、长分支支链淀粉（Fb3）含量有正向作用，对籼型株系和粳型株系短支链淀粉（Fa）含量有正向作用。 其作用机理还有待进一步研究。