水稻籼粳性特异分子标记的筛选与判别体系的建立

董景芳，李学忠,2，张少红，刘斌，赵均良，杨梯丰

（1.广东省农业科学院水稻研究所/ 广东省水稻育种新技术重点实验室/ 广东省水稻工程实验室/农业农村部华南优质稻遗传育种重点实验室，广东 广州 510640；2.仲恺农业工程学院农业与生物学院，广东 广州 510225）

【研究意义】水稻（Oryza sativaL.）是世界上最重要的粮食作物之一，目前全球超过一半以上人口以水稻为主食［1］。水稻在漫长的驯化过程中，形成了明显的遗传分化，其中籼粳亚种分化是其分化的主流。探究水稻品种（系）的籼粳属性是研究水稻亚种起源以及籼粳亚种杂交利用的基础。【前人研究进展】目前，水稻的籼粳性主要从形态学标记、生化标记和分子标记等方面进行区分。在国内由程侃声［2］创立的亚洲稻籼粳亚种“程式指数鉴别法”是当前鉴定水稻亚种最为流行的方法，但该法不仅需要植株成熟，还需考察许多农艺性状，较繁琐和复杂，且植株长势和长相受生长环境影响较大。此外，现在许多水稻品种（系）都渗入了籼/粳成分，单纯利用“程式指数鉴别法”已经很难精确判别其籼粳性。相比于形态学和生化方法，分子标记直接反映核苷酸序列上的变异，具有灵敏度高、稳定性好、不受环境影响等优势，因此在水稻籼粳分类［3-9］以及分子育种［10-12］等方面都发挥重要作用。其中，SSR 标记［13-18］和InDel 分子标记［19-23］具有基因组分布广泛、检测技术简单和费用低等特点，已被广泛应用于水稻籼粳属性鉴定。

【本研究切入点】目前虽然已经公布了一批可用来进行籼粳性判别的分子标记［13-16,23］，但这些籼粳性判别分子标记在进行籼粳性判别试验中所用的试材往往较少或遗传背景较狭窄［21-22］，这些分子标记在遗传背景多样的试材中，是否仍然表现出籼粳特异性是未知的。此外，目前籼粳性的判别多是基于与2 个对照品种9311（籼稻）和日本晴（粳稻）的比较，无法准确反映待测品系与籼（粳）亚种群体的籼粳相似性，从而无法准确区分偏籼（粳）水稻品种（系）。【拟解决的关键问题】筛选出一套能特异判别籼粳性的分子标记，并采用代表籼稻和粳稻亚种的组群为参照计算待测品系的籼粳相似性，可以更准确判别检测品系的籼粳性。为筛选出籼粳性特异分子标记，并构建一套基于籼粳组群的水稻籼粳性的判别体系，本研究在能代表世界水稻遗传多样性的水稻多样性种质平台2（RDP2）中，根据覆盖全基因组的7 万个SNP 分子标记的基因型选取了保留群体多样性的92 份水稻品种（系）为供试材料［24］，用已经公布的51 对籼粳特异分子标记进行检测［13-16,23］。根据检测结果，筛选出24 对能特异地判别籼粳性的分子标记；根据24 对分子标记的籼粳性聚类结果，选取其中10 份品种（系）（5份籼稻、5 份粳稻）分别组成籼性和粳性判别组，根据待测品系与判别组的相似度客观判定待测品系的籼粳性。

1 材料与方法

1.1 试验材料

在水稻多样性种质平台2（RDP2），根据70 万个SNP 标记基因型，从12 条染色体中均匀选取7 万个SNP 标记，对保留了水稻遗传多样性的377 份稻种进行聚类分析［24］，根据聚类结果选取保留了群体遗传多样性的92 份水稻品种（系）为供试材料，其中籼稻47 份，粳稻45 份（表1）；于2016 年晚季种植于大丰农场，成熟后按株系收获种子，取30 粒发芽种子提取DNA进行试验。

表1 92 份水稻品种（系）试材Table 1 92 rice varieties for test

1.2 用于筛选的分子标记

根据前期相关研究，选择可区分籼粳性的SSR 引物17 对［13-16］和InDel 标记34 对［23］，这些标记在水稻12 条染色体上都有分布，详细信息见表2。

1.3 DNA 提取、PCR 反应及带型检测

取适量嫩芽，一一对应放入96 孔培养板，加入600 µL 蔗糖提取液（成分：6.1 g/L Tris、17.5 g/L NaCl、102.7 g/L 蔗糖、pH 8.0），在组织研磨仪中打碎组织（1 200 r/min，40 s），95 ℃水浴30 min 后，2 000 r/min 离心10 min，上清液即为DNA 模板。

PCR 反应体系：2×Es Taq MasterMix 7.5 μL，10 μmol/L 引物0.5～0.8 μL，DNA 模板2.0 μL，补灭菌水至15.0 μL。

PCR 反应流程：94℃预变性5 min；94℃变性30 s、51～60℃退火30 s、72℃延伸45 s，35 个循环；72℃延伸8 min。

PCR 扩增结束后，在电压为105 V 的情况下，进行8.0% PAGE 胶电泳，电泳结束后将PAGE胶放入纯水溶解的10-4GoldView 溶液中染色10～15 min，然后用凝胶成像系统检测带型。

1.4 专一带型频率计算

以对照品种9311 和日本晴的带型为标准，与9311 带型一致的为籼型条带，与日本晴带型一致的为粳型条带。

籼型专一带型频率=〔2×纯合籼型条带数＋籼性条带数（杂合带型）〕/（2×籼稻数）；

粳型专一带型频率=〔2×纯合粳型条带数＋粳型条带数（杂合带型）〕/（2×粳稻数）

1.5 聚类分析

利用NTSYS-pc Version 2.1e 进行测试品种（系）籼粳聚类分析。把每个标记的籼粳特异带型转化为二进制数据（1 为有带，0 为无带），先通过SIMQUAL 程序，利用SM 系数计算相似性矩阵，再通过SHAN 程序，根据UPGMA 方法进行聚类分析［25］。

1.6 籼性判别值计算

式中，Di为籼性判别值，Si（Sj）为待测系与籼（粳）型测验群的平均相似系数，SKi（SKj）为待测系与各籼（粳）型测验种的相似系数，其中Ki（Kj）=1……Ni（Nj），Ni（Nj）为籼（粳）型测验种的个数；S为指采用DICE 方法（2×共有带型数目/〔2×共有带型数目+品系1 特有带型数目+品系2 特有带型数目〕）计算出2 个品系的相似系数。计算出的籼性判别值对应籼粳属性，具体标准如下：Di≤0.25 为粳，0.25＜Di≤0.5 为偏粳，0.5＜Di≤0.75 为偏籼，0.75＜Di为籼［26］。

2 结果与分析

2.1 筛选出24 对籼粳特异分子标记

利用92 份来自世界各地的籼稻和粳稻品种（系），对51 对籼粳分化分子标记进行特异性检测，发现27 对分子标记判别籼粳性的特异性不高（表2）。主要有以下3 种情况：如R1M37 在检测群体中出现偏态分布，在检测群体中倾向出现籼型条带；R12M27 扩增条带模糊，且在检测群体中倾向出现粳型条带；RM240 的多态性很高，在检测群体中出现多种带型，不具备籼粳特异性（图1）。

表2 51 对用于籼粳判别的分子标记Table 2 51 pairs of molecular markers for indica-japonica discrimination

有24 对分子标记的籼粳特异性好，适用于水稻的籼粳性判别（图2）。这些标记在籼（粳）稻群中出现专一带型的频率均高于69.5%，其中12对分子标记（R1M7、RM104、R2M10、R2M24、R2M50、R3M10、RM130、R5M30、R7M37、R8M46、R9M42、R12M43）在籼（粳）稻群中出现专一带型的频率均高于0.900（表3）。R2M50在粳稻群体出现专一带型频率为1；15 对分子标记在粳稻群体出现专一带型频率均高于0.950。R1M7 和R9M42 在籼稻群体出现专一带型频率均为0.989；8 对分子标记在籼稻群体出现专一带型频率均高于0.950。

表3 籼粳专一标记在籼稻和粳稻群体中出现的频率Table 3 Occurrence frequency of indica-japonica specific molecular markers in indica and japonica rice populations

24 对分子标记均匀分布在水稻的12 条染色体上，其中在第1、2、3、4 号染色体上各有3对籼粳性特异的分子标记；在第6、7、8、11 号染色体上各有2 对籼粳性特异的分子标记；其余4 条染色体上各有1 对籼粳性特异的分子标记（表2）。

2.2 基于24 对籼粳特异分子标记的水稻籼粳性聚类分析

根据籼粳专一分子标记的带型结果，对92份水稻品种（系）进行籼粳性聚类分析。聚类结果（图3）显示，92 份品种（系）可分为籼稻和粳稻2 个组群，其中籼稻47 份、粳稻45 份，与这些品种（系）已知的籼粳属性完全吻合。

通过聚类发现，在籼稻群中各品种（系）籼粳性的相似系数仍有较大差异，如482I、1400I、656I、1203I、933I、621I、1052I，它们与籼稻群中其他品种（系）籼粳性的相似系数低于0.85；类似地，在粳稻群中各品种（系）籼粳性的相似系数也有较大差异，如919J、1226J、1222J、1003J、846J、1089J，它们与籼稻群中其他品种（系）籼粳性的相似系数也低于0.85。说明在亚群中存在籼（粳）和偏籼（粳）属性的差异，只有对水稻的籼粳性进行量化，才能客观准确地评价亚群中水稻的籼（粳）和偏籼（粳）属性。

2.3 用籼性判别值量化水稻的籼粳性

为构建一套高效准确的籼粳性判别体系，根据24 对籼粳特异分子标记的聚类结果，按照各品种（系）的相似系数选择5 份籼稻（44I、541I、1365I、1400I、9311）和5份粳稻（50J、973J、1226J、1255J、NIP），分别作为籼性判别组（包括典型籼稻和偏籼品系）和粳性判别组（包括典型粳稻和偏粳品系）。随机选取其他10 份品种（系）（5 份籼稻、5 份粳稻），对其籼性判别值进行计算，结果（表4）显示其中1 份偏籼品系、1 份偏粳品系、4 份籼稻品系、4 份粳稻品系，高效准确地实现了对它们籼粳性的量化判别。

表4 检测品系的籼性度及籼粳属性Table 4 Indica quality degree and indica-japonica nature of the tested lines

3 讨论

3.1 24 对籼粳特异性分子标记能准确区分水稻的籼粳性

前期已有不少研究利用SSR 和InDel 分子标记分析水稻的籼粳性。本研究选取的51 对用于籼粳判别的分子标记，在已报道的测验群体中都具有较高的籼粳识别性［14-24］。我们选用来自世界各地遗传多样性丰富的92 份品系，利用分子标记进行籼粳判别时，发现一半以上的标记判别籼粳性的能力不强，主要表现为多态性高、容易出现偏态分布等（图1）。这可能是由于选材不同，导致判别籼粳性的能力出现差异。但我们也发现有24 对分子标记在多个遗传背景丰富的群体中，仍然表现较好的籼粳识别性（图2）。可以预见，这些标记将在水稻籼粳判别中具有普适性，能突破遗传材料的制约，准确判别水稻的籼粳性。

在水稻的基因组上，存在一些多态性很高的位点，这类位点适用于水稻品系分子身份证的构建识别。类似地，在水稻的基因组上也存在一些相对保守的变异位点，如在籼稻或粳稻中特异存在的基因组变异。本研究筛选出的24 对分子标记，检测带型专一，属于这类变异位点，便于通过电泳检测，准确识别籼粳属性。当然，单一位点的判别，不足以代表整个基因组的信息，因此我们挑选的这24 对籼粳识别度高的分子标记，均匀地分布在水稻的12 条染色体上，较全面地代表了水稻全基因组的信息，从而更有利于准确判别水稻的籼粳性。

3.2 籼性判别值可以客观地评价水稻品系的籼粳性

对水稻品种（系）籼粳属性的准确评价，特别是偏籼和偏粳材料的判别在籼粳亚种杂种优势利用中显得尤其重要。以往研究通常以单个材料为籼型或者粳型对照，无法准确反映待测品系与籼（粳）亚种的相似性。这就可能造成籼粳性的误判，特别是无法准确反映待测品种（系）的偏籼（粳）性。本研究提出通过计算“平均相似系数”，即某一被测系与各籼型测验种或粳型测验种相似系数的平均值，这能够反映某被测系与籼亚种或粳亚种间的遗传相似性。在此基础上用“籼性判别值”（Di）可以度量某被测系与籼亚种间的相对遗传相似性。

在进行待测品系的籼（粳）判别时，往往选取的参照材料越丰富多样，越能全面反映籼（粳）稻属性的客观情况。但是，如果选取的试材多，显然会增加检测时间和成本；而只选取单个的参照材料又无法反映待测品系与籼（粳）亚种的相似性。在本研究中，我们依据籼粳特异分子标记的聚类结果挑选了5 份籼稻和5 份粳稻组成籼性判别组和粳性判别组，包括典型的籼（粳）稻和偏籼（粳）稻，能较好地代表水稻籼（粳）稻亚种群体内的籼（粳）性真实属性。通过计算待测系与判别组群内品系的相似系数客观反映待测品系与籼（粳）稻亚种群体的相似性，从而准确判别待测系的籼粳性。该体系对水稻品种（系），特别是偏籼（粳）水稻品种（系）的籼粳性有更加客观的评判，有助于提高籼粳亚种杂种优势利用的效率。

4 结论

本研究以92 份来自世界各地、具有遗传多样性的水稻品种（系）为材料，利用已公布的51对籼粳特异分子标记进行检测，筛选出均匀分布在水稻12 条染色体上的24 对能特异地判别籼粳性的分子标记，其中有12 对分子标记在籼（粳）稻群中出现专一带型频率均高于90.0%；根据这24 对籼粳特异分子标记的籼粳性聚类结果，选取其中10 份品种（系）分别组成籼性（包括典型籼稻和偏籼品系）和粳性（包括典型粳稻和偏粳品系）判别组，然后根据待测品系与判别组的相似度客观判定了待测品系的籼粳性。可见，本研究基于籼粳特异分子标记建立了一套高效准确判别水稻籼粳性的体系。