具有益生潜力的乳酸杆菌筛选

徐显睿，李翠凤，杨洪来，隋勇军，李道河，张宗博，陈政言，张兰威*

（1.青岛根源生物技术集团有限公司食品实验室，山东 青岛 266000；2.青岛诺和诺康实业有限公司，山东 青岛 266000；3.中国海洋大学食品科学与工程学院，山东 青岛 266000）

益生菌是活的微生物，摄入充足数量益生菌能够对宿主产生一种或多种已论证功能性的健康益处（联合国粮农组织/世界卫生组织）[1]。乳酸杆菌是典型的有益人体肠道健康益生菌，其在肠道中定植、繁殖，进而改善肠道环境，维持肠道菌群平衡[2]。乳酸杆菌促进肠道健康[3]、提高免疫力[4]、预防肠胃疾病等有益功能的前提条件是耐受胃肠道的防御机制，即耐受胃中较高的酸度和小肠中较高的胆盐浓度[5]。此外，乳酸菌需黏附在小肠上皮细胞且保持一定数量，才能在肠道中停留相对长的时间，从而对宿主细胞发挥益生功能[6-7]。乳酸菌的表面特性是影响黏附能力的重要因素[8]。乳酸菌的凝集能力与其黏附宿主细胞的能力具有相关性，凝集能力越强的乳酸菌在肠道中定植能力越好[9-10]。李洋等[11]从青海酸牦牛乳中分离得到11 株乳酸菌，通过耐酸、耐胆盐实验筛选出1 株鼠李糖乳杆菌，该菌在人工胃液和0.3 g/100 mL胆盐中的存活率分别为119.53%和11.64%。赵彤[12]对1 株开菲尔乳杆菌KL22进行耐酸、耐胆盐、疏水和自聚能力验证，并经后续细胞实验表明该菌株对肠道有较强的黏附能力。向鑫铃等[13]研究乳酸杆菌的疏水、自聚等表面性质与黏附能力的关系，结果表明，乳酸杆菌表面性质与黏附性有很大关系，可以通过菌体表面性质对具有黏附性的益生菌进行初步快速筛选。

本研究以30 株可用于食品中的乳酸菌为研究对象，通过耐酸、耐胆盐、疏水作用、静电作用和自聚能力初步评价各菌株耐酸、耐胆盐和对细胞的黏附能力，进而筛选出对消化系统耐受性较强的抗性菌株，旨在为研究、开发潜在功能性益生菌提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

30 株可用于食品中的乳酸菌，分别为菌株Z-40、Z-32、Z-9、Z-6、Z-11、Z-3、Z-13、Z-8、Z-17、Z-7、Z-37、Z-16、Z-34、Z-39、Z-15、Z-33、Z-1、Z-12、Z-35、Z-38、Z-5、Z-41、Z-36、Z-45、Z-46、Z-43、Z-42、Z-44、Z-40、Z-4，均分离自西藏、新疆、青海地区传统自然发酵样品，由青岛根源生物技术集团有限公司食品菌株资源库提供；鼠李糖乳杆菌LGG购于丹麦科汉森公司。

MRS肉汤培养基 青岛海博生物技术有限公司；牛胆盐 北京奥博星生物技术有限责任公司；浓盐酸、NaCl、NaOH、Na2HPO4、KH2PO4、KCl、二甲苯、乙酸乙酯、氯仿、L-半胱氨酸 （均为分析纯） 国药集团化学试剂（上海）有限公司。

1.2 仪器与设备

YXQ-LS-50SⅡ立式高压蒸汽灭菌锅 上海博迅实业有限公司医疗设备厂；SW-CJ-1F超净工作台 苏州安泰空气技术有限公司；AG050厌氧培养罐 广州雷得生物技术有限公司；SE6001FZH电子天平 美国奥豪斯公司；MEI04E分析天平 瑞士梅特勒-托利多公司；TG16-WS台式高速离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；PHS-3C pH计 上海仪电科学仪器股份有限公司；756PC紫外-可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司；LRH-250生化培养箱、BWS-12G电热恒温水槽 上海一恒科学仪器有限公司；MX-S旋涡振荡器 美国赛洛捷克公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株活化

将供试菌株按体积分数1%接种量接种到MRS肉汤培养基中进行活化，经2 次传代，37 ℃恒温培养箱中培养16 h，收集对数生长期的菌液。

1.3.2 菌体制备

将活化的供试菌株接种于MRS和MRS+L-半胱氨酸液体培养基，37 ℃静置培养24 h，4 ℃、8 000×g离心10 min，收集菌体。用pH 6.8无菌磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）洗涤2 次，将菌体用4～8 mL pH 6.8无菌PBS重悬，备用。

1.3.3 菌株耐酸和耐胆盐能力测定

将活化的供试菌株分别接种于pH 4.0的MRS液体培养基和添加0.5 g/100 mL胆盐的MRS液体培养基，于37 ℃恒温培养箱中静置培养18 h，以接种鼠李糖乳杆菌LGG作为对照，用石英比色杯测定各菌株在600 nm波长处的光密度（optical density，OD600nm）[14-17]。

1.3.4 菌株疏水率测定

用pH 6.8无菌PBS将1.3.2节菌悬液OD600nm调至0.6，加入1 mL疏水溶剂二甲苯，静置5 min后充分振荡120 s，再静置10 min取水相，以鼠李糖乳杆菌LGG为对照，用石英比色杯测定OD600nm[18]，疏水率按式（1）计算。

式中：OD0为菌悬液初始OD600nm；OD1为静置10 min后水相OD600nm。

1.3.5 菌株静电作用率测定

以氯仿为路易斯酸，乙酸乙酯为路易斯碱[19]，用pH 6.8无菌PBS将1.3.2节菌悬液OD600nm调至0.6，加入1 mL氯仿（或1 mL乙酸乙酯），静置5 min后充分振荡120 s，再静置10 min取水相，以鼠李糖乳杆菌LGG作为对照，用石英比色杯测定OD600nm，静电作用率按式（2）计算。

式中：OD0为菌悬液初始OD600nm；OD1为静置10 min后水相OD600nm。

1.3.6 菌株自凝聚率测定

用pH 6.8无菌PBS将1.3.2节菌悬液OD600nm调至0.6，于37 ℃分别静置2、4 h，以鼠李糖乳杆菌LGG作为对照，测定上层液体OD600nm[20]，自凝聚率按式（3）计算。

式中：OD0为菌悬液初始OD600nm；OD1为静置后菌悬液上层液体OD600nm。

1.3.7 菌株耐人工模拟胃酸和肠液能力测定

选择在耐酸、耐胆盐、疏水率、静电作用率和自凝聚率某一方面或多方面表现优秀的菌株在MRS肉汤培养基中活化传代3 次获得菌液；在4 ℃、4 000×g条件下离心10 min收集菌体，用无菌超纯水洗涤2 次，等体积重悬于模拟胃液或模拟肠液；在模拟胃液中孵育15、30、60 min，取重悬液10 倍梯度稀释后涂布于MRS琼脂培养基平板，37 ℃培养48 h进行活菌计数；在模拟肠液中孵育5 h，取重悬液10 倍梯度稀释后涂布于MRS琼脂培养基平板，37 ℃培养48 h进行活菌计数。以鼠李糖乳杆菌LGG作为对照，分别计算各菌株存活率，菌株存活率按式（4）计算。

式中：B0为菌悬液初始菌数/（CFU/mL）；B1为模拟胃液或模拟肠液处理后菌悬液菌数/（CFU/mL）。

1.4 数据处理

采用OriginPro 8.5软件作图。

2 结果与分析

2.1 供试菌株耐酸、耐胆盐能力测定结果

乳酸菌被人体摄入后由口腔进入消化道过程中，胃液中的强酸环境首先成为大多数有益乳酸菌进入肠道发挥益生功效的阻碍。此外，进入到肠道中的乳酸菌对胆盐的耐受性也是益生菌筛选的重要标准。

图1 菌株耐酸和耐胆盐能力测定结果Fig. 1 Acid and bile salt tolerance of 31 strains

由图1可知，菌株Z-3、Z-8、Z-17、Z-16、Z-1、Z-12、Z-15、Z-36、Z-38、Z-39、Z-41、Z-45和Z-46共13 株菌表现出较好的耐酸和耐胆盐能力，其中菌株Z-3、Z-17、Z-16、Z-1、Z-39和Z-45的耐酸能力明显高于对照菌株鼠李糖乳杆菌LGG，OD600nm分别为2.232、2.163、2.189、2.135、2.134和2.237，而菌株Z-12、Z-15、Z-36、Z-38、Z-41、Z-46的耐酸能力接近于鼠李糖乳杆菌LGG，OD600nm为1.772～1.996。

上述对酸耐受性较好的13 株菌株，对胆盐同样表现出良好的耐受性。菌株Z-17在质量浓度0.5 g/100 mL胆盐中耐受性最好，OD600nm为1.839，明显高于鼠李糖乳杆菌LGG（OD600nm＝1.239），表明菌株Z-17的耐胆盐能力明显优于鼠李糖乳杆菌LGG。其他菌株表现出与鼠李糖乳杆菌LGG近似的胆盐耐受能力，OD600nm为0.840～1.311。

2.2 供试菌株疏水率测定结果

图2 菌株疏水率测定结果Fig. 2 Hydrophobicity of 31 strains

在益生菌体外筛选实验中，菌株表面疏水性在一定程度上与菌株在体内的定植能力呈正相关[16,21]。由图2可知，菌株Z-4、Z-40、Z-32、Z-3、Z-13、Z-7、Z-37、Z-39、Z-15、Z-1、Z-38、Z-36和Z-43共13 株菌具有较强的表面疏水性，其中菌株Z-40、Z-3、Z-7、Z-39、Z-15、Z-1、Z-36和Z-43的疏水率均高于92%，明显高于其他疏水性良好菌株。菌株Z-40、Z-3和Z-1的疏水性最强，疏水率分别为98.50%、97.57%和97.52%；菌株Z-4、Z-32、Z-13、Z-37、Z-38的疏水率也明显高于鼠李糖乳杆菌LGG，为68.88%～78.74%。

2.3 供试菌株静电作用率测定结果

在肠道中，益生菌以特异性和非特异性2 种方式黏附于小肠黏膜，非特异性方式主要与静电作用力和疏水作用力有关[22]。与菌株疏水率类似，菌株的表面电荷量可以反映其在肠道的定植能力[23]。

图3 菌株静电作用率测定结果Fig. 3 Surface charge of 31 strains

由图3可知，鼠李糖乳杆菌LGG对氯仿和乙酸乙酯的静电作用率别为85.26%和11.06%，表明该菌株表面携带可产生静电作用的电荷量。菌株Z-40、Z-3、Z-7、Z-16、Z-39、Z-15、Z-1、Z-38、Z-36和Z-43共10 株菌表现出较强的静电作用力，对氯仿和乙酸乙酯的静电作用率均高于鼠李糖乳杆菌LGG，其中菌株Z-43和Z-15对氯仿表现出较高的静电作用率，达100.00%和99.16%，其次为菌株Z-40、Z-39、Z-36、Z-7、Z-1，静电作用率分别为97.95%、97.76%、97.73%、97.56%和97.35%，其他优选菌株对氯仿的静电作用率为85.14%～91.24%；菌株Z-16对乙酸乙酯的静电作用率最高，为72.50%，其他优选菌株对乙酸乙酯的静电作用率为20.78%～33.98%，是鼠李糖乳杆菌LGG的2～3 倍。

2.4 供试菌株自凝聚率测定结果

乳酸菌的高自凝聚作用不仅有利于提高其在肠道中的水平，还有利于菌体在小肠黏膜上定植，共同促使有益菌更好发挥益生功效[24-25]。

图4 菌株自凝聚率测定结果Fig. 4 Auto-aggregation ability of 31 strains

由图4可知，各供试菌株的自凝聚率与孵育时间基本呈正相关，孵育时间越长，菌株自凝聚能力越强。菌株Z-6、Z-5、Z-36、Z-46、Z-43、Z-4共6 株菌孵育2、4 h的自凝聚率均高于鼠李糖乳杆菌LGG，其中菌株Z-5和Z-4自凝聚能力最强，菌株Z-5孵育2、4 h的自凝聚率分别为34.46%和33.97%，菌株Z-4孵育2、4 h的自凝聚率分别为30.95%和33.16%。

2.5 优选菌株耐模拟胃肠液能力测定结果

对30 株可用于食品中的乳酸菌进行耐酸、耐胆盐指标初步评价，共筛选出13 株菌，再对30 株供试菌株以疏水率、静电作用率和自凝聚率3 个指标进行菌株黏附性评价，在符合耐酸、耐胆盐指标基础上，得到Z-7、Z-43和Z-5 3 株新菌株，其中菌株Z-7、Z-43表现出较好的疏水性和静电作用，菌株Z-5自凝聚率最高。

从供试菌株中筛选具有潜在益生功效的优选菌株，其在耐酸、耐胆盐、疏水率、静电作用率和自凝聚率指标上单方面或多方面优于对照菌株鼠李糖乳杆菌LGG。根据上述研究结果，符合要求的菌株为Z-8、Z-40、Z-3、Z-17、Z-12、Z-16、Z-1、Z-15、Z-38、Z-39、Z-36、Z-45、Z-46、Z-43、Z-5和Z-7共16 株，对其进行模拟胃液和模拟肠液耐受性实验。

图5 优选菌株对模拟胃液的耐受性Fig. 5 Gastric acid tolerance of selected strains

由图5可知：菌株Z-1、Z-38、Z-36和Z-16在模拟胃液中表现出较优的耐受能力，在模拟胃液中孵育60 min活菌数仍较高，其中菌株Z-1对模拟胃液的耐受性最好，在模拟胃液中孵育60 min的存活率高达93.07%，其次为菌株Z-36，在模拟胃液中孵育60 min的存活率为65.66%，菌株Z-16、Z-38在模拟胃液中孵育60 min的存活率分别为14.44%和22.64%；上述菌株较对照菌株鼠李糖乳杆菌LGG均表现出更好的模拟胃液耐受能力，而菌株Z-7、Z-43和Z-5模拟胃液耐受能力低于鼠李糖乳杆菌LGG。

图6 优选菌株对模拟肠液的耐受性Fig. 6 Intestinal viability of selected strains

由图6可知，16 株菌在模拟肠液中均表现出较好的耐受能力，其中菌株Z-3、Z-12、Z-1、Z-45、Z-5在模拟肠液中孵育5 h的存活率超过100%，分别为101.7%、109.16%、106.5%、103.26%和112.83%。

综上可知，菌株Z-1在模拟胃液和模拟肠液中的耐受能力最强，其在模拟胃液中孵育60 min和模拟肠液中孵育5 h的存活率分别为93.07%和106.5%。

3 结 论

对30 株可用于食品中的乳酸菌进行耐酸、耐胆盐指标初步评价，共筛选出13 株菌，再对30 株供试菌株以疏水率、静电作用率和自凝聚率3 个指标进行菌株黏附性评价，在符合耐酸、耐胆盐指标基础上，得到Z-7、Z-43和Z-5 3 株新菌株。其中Z-7、Z-43株菌表现出较好的疏水性和静电作用，菌株Z-5自凝聚率最高。

对16 株在耐酸、耐胆盐、疏水率、静电作用率和自凝聚率指标上单方面或多方面优于对照菌株鼠李糖乳杆菌LGG的菌株进行模拟胃液和模拟肠液耐受性实验，共筛选出Z-1、Z-16、Z-38和Z-39 4 株在模拟胃液中孵育60 min存活率较高的菌株，16 株菌在模拟肠液中的存活率均较高，其中菌株Z-1在模拟胃液中孵育60 min和模拟肠液中孵育5 h的存活率分别为93.07%和106.5%，并且菌株Z-1的疏水率为97.52%，其对氯仿和乙酸乙酯的静电作用率别为97.35%和24.67%，均表明菌株Z-1具有极强的肠道定植能力。