院内制剂灵芝调脂茶的质量研究

李琼 徐斌 王权

[摘要] 目的 建立灵芝调脂茶的质量控制方法。 方法 采用薄层色谱法（TLC）鉴别灵芝;高效液相色谱法测定绿原酸的含量。 结果 灵芝的TLC鉴别特征性明显、专属性强;绿原酸在25.40～253.97 μg/mL（r2 = 0.9991）线性关系良好，平均回收率为100.14%，RSD为1.6%。 结论 本研究方法简便易行，结果良好，能有效控制药品的质量，为制定灵芝调脂茶的质量标准提供依据。

[关键词] 灵芝调脂茶;灵芝;绿原酸;薄层色谱法;高效液相色谱法

[中图分类号] R927.2          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2020）03（c）-0111-03

[Abstract] Objective To establish the quality standard for Linzhitiaozhi Tea. Methods Thin layer chromatography （TLC）  was adopted in the qualitative identification of Ganoderma. High performance liquid chromatography was used for the content determination of chlorogenic acid. Results The spots of TLC were distinctive without negative interference. The response of chlorogenic acid was linear in the range of 25.40-253.97 μg/mL （r2 = 0.9991）， the average recoverie was 100.14%， RSD was 1.6%. Conclusion This reasonable and feasible method can be used for the quality control of Linzhitiaozhi Tea.

[Key words] Linzhitiaozhi Tea; Ganoderma; Chlorogenic acid; Thin layer chromatography; High performance liquid chromatography

靈芝调脂茶是安微省芜湖市中医医院的院内制剂，具有活血化瘀、补气生血、改善记忆功能的功效，主要用来治疗冠心病、脑血管等心脑血管系统疾病[1]。临床长期应用以来，效果确切，但质量标准建立于2005年，时间久，要求比较低，仅做一些常规检验，并没有系统性的质量标准的研究与建立，难以有效的控制药品的质量。本方中灵芝主要含有多糖、三萜类、核苷等化合物[2-4]，具有抗衰老、抗阿尔茨海默症、抗氧化及防治动脉粥样硬化的作用[5-9];菊花、罗布麻、茉莉花均含有一定量的绿原酸[10-12]，绿原酸对于降压降脂、保护心血管和抗肝纤维化等有良好治疗作用[13-17]。针对以上，本研究以灵芝药材和绿原酸为主要控制指标，通过定性定量的方法，为其建立稳定有效的质量标准提供实验依据。

1 材料

xp-20百万分之一电子分析天平（梅特勒-上海托利多）;GoodSee-20E薄层色谱成像系统（上海科哲生化科技有限公司）;Waters e2695-2489 高效液相色谱仪（美国沃特世公司），2489紫外检测器，2695四元泵，2695脱气机及2695自动进样器;ZRS-8G智能溶出仪（天津天光光学仪器有限公司）。

灵芝调脂茶（批号：180503、190110、190205、190305，自制，每袋重3 g）;绿原酸对照品（批号：110753-201415，纯度为93.4%），灵芝对照药材（批号：120968-201408）购自中国食品药品检定研究院;乙腈、磷酸均为色谱纯;其他试剂均为分析纯;水为高纯水。

2 方法与结果

2.1 灵芝的薄层色谱鉴别

参考《中华人民共和国药典》[18]方法，取3批灵芝调脂茶内容物各约2 g，置于锥形瓶中，加95%的乙醇40 mL振摇混匀后超声提取，超声30 min后，取出，冷却至室温，滤过，取续滤液，水浴上蒸干，将剩余的物质加入1 mL甲醇使溶解，作为供试品溶液;取灵芝对照药材1 g，加95%的乙醇40 mL超声提取，选用功率250 kW，频率40 kHz，超声30 min后，取出，冷却至室温，滤过，取续滤液，蒸干后加1 mL甲醇使溶解，作为相应的对照药材溶液;取缺灵芝药材的缼味制剂2 g，按上述方法，制成阴性对照溶液。吸取对照药材溶液、供试品溶液及阴性对照溶液各3 μL，依次按序点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚（60～90℃）-乙酸乙酯（8∶1）的混合溶液为展开剂，置展开槽中展开，待前沿距离板上缘1 cm取出，晾干，置于紫外灯波长365 nm下检视。供试品溶液与对照溶液在相同位置上荧光斑点一致，阴性对照在同一位置上没有斑点。此鉴别方法稳定可行，专属性强。见图1。

1：灵芝对照药材;2～4：3批供试品溶液;5：阴性对照溶液

2.2 绿原酸的含量测定

2.2.1 对照品储备液的配制  精密称取绿原酸对照品13.59 mg，加50%的甲醇定容至25 mL，作为对照品储备液。

2.2.2 供试品溶液的配制  灵芝调脂茶的内容物过3号筛，取约1 g，精密称定，置于250 mL锥形瓶中，精密量取50 mL的50%甲醇，加入，密塞，称定重量，超声提取（250 kW，40 kHz）30 min，取出，静置冷却至室温，称定重量，减失的重量用50%的甲醇补足后混匀，滤纸过滤，吸取滤液，用针式过滤过0.22 μm微孔滤膜，取续滤液，即得供试品溶液。

2.2.3 阴性对照溶液的配制  取按本品处方比例的缺菊花、罗布麻、茉莉花的阴性样品，按照处方工艺制备成缼味制剂，再根据“2.2.2”项方法操作，制备成阴性对照溶液。

2.2.4 色谱条件  色谱柱：Waters XBridge C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流动相：0.2%磷酸水溶液（A）-乙腈（B）等度洗脱（90∶10），流速：1.0 mL/min;柱温：30℃;检测波长：348 nm[18-20]。进样量10 μL。

2.2.5 专属性考察  取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液，按照“2.2.4”项，注入色谱仪中，测定，每次进样10 μL。样品中的其他成分对于绿原酸的测定无干扰。见图2。

2.2.6 精密度的考察  取浓度为25.4 μg/mL的对照品溶液，连续6次进样，记录绿原酸的峰面积353 478、 355 320、3 557 795、354 822、355 546、366 114，RSD = 1.3%，<2.0%，仪器的精密度良好。

2.2.7 标准曲线  精密吸取“2.2.1”项下对照品储备液1、2、4、6、8、10 mL，分别置于量瓶中，加50%的甲醇溶液稀释至10 mL，振摇混匀，依照“2.2.4”项下色谱条件进样，记录峰面积，以对照品浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行线性回归，得到绿原酸的回归方程为Y = 12 821X+76 702（r2 = 0.99 91），即绿原酸在25.40～253.97 μg/mL范围内线性关系良好。

2.2.8 稳定性的考察  取同一批样品（180503）按“2.2.2”项下现制成供试品溶液，在制备后于0、2、4、8、16、24 h按“2.2.4”项下色谱条件进样，测定绿原酸的峰面積612 726、622 544、623 708、624 255、617 504、620 678，绿原酸在24 h内峰面积的RSD为0.7%（n = 6），供试品溶液24 h内稳定性良好。

2.2.9 重复性的考察  取同一批号的样品（180503），精密称定1 g，共6份，按“2.2.2”项平行制备成供试品溶液，分别进样，测定峰面积，计算得知绿原酸的含量为2.037、2.037、2.070、2.054、2.038、2.040 mg/g，平均含量为2.046 mg/g，RSD = 0.7%，即该方法的重复性良好。

2.2.10 回收率试验  称取已知含量的供试品1 g，精密称定，共计6份，分别精密加入一定量的对照品，按“2.2.2”项供试品溶液方法制备，进样10 μL，注入色谱中进行检测分析。见表1。

2.2.11 3批样品的含量测定  精密称取3批样品（批号：190110、190205、190305）各约1 g，按照“2.2.2”项下方法分别制成供试品，依“2.2.4”测定绿原酸含量。见表2。

3 讨论

薄层色谱鉴别中超声提取和回流提取两种方式，均能有效提取，因考虑操作便利性，选择超声提取方式;展开剂的选择中，考察了正己烷-乙酸乙酯（8∶1）和石油醚-乙酸乙酯（8∶1），石油醚-乙酸乙酯（8∶1）系统中样品的主斑点更清晰，识别度高，因此选用其作为展开剂。含量测定中供试品的提取溶剂选用50%甲醇和稀乙醇进行对比考察，发现50%的甲醇提取效率要高于稀乙醇，且杂质少，峰型良好，因此选用50%甲醇。通过薄层色谱鉴别灵芝，方法简便、可靠、专属性强，高效液相色谱方法稳定、可控、专属性好为灵芝调脂茶质量标准的制定提供切实的依据，可更好地控制灵芝调脂茶的质量，以保障药品的均一性、稳定性和有效性。

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（收稿日期：2019-08-27  本文編辑：刘永巧）