MicroRNA-199a-5p和HIF-1α在慢性阻塞性肺疾病上皮细胞中的表达及相关性*

李 新,努尔阿米娜·铁力瓦尔迪,穆清爽,古力鲜·马合木提

(新疆医科大学第二附属医院呼吸内科，新疆乌鲁木齐830063)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是影响中老年群体重要的呼吸系统疾病，以反复发作肺部感染、呼吸受限为主要临床表现，可进展至呼吸衰竭，甚至猝死。据数据显示[1]，COPD已成为我国疾病主要死亡原因第四位，随着环境污染和人口老龄化加剧，患病率和病死率还在不断上升，严重威胁国民生活质量。研究一致认为COPD的发生与环境、气道高反应和慢性炎症密切相关[2]，吸烟、粉尘颗粒和气道微生物常常作为COPD的始动和加重因素，诱导机体气道高反应性和慢性炎性反应[3]，多种细胞成分如肥大细胞、上皮细胞、成纤维细胞、巨噬细胞聚集，进而释放多种细胞因子和炎症介质，如缺氧诱导因子(HIF)-1α[4]、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、MicroRNA-199a-5p[5]等，最终导致COPD的发生和发展。

上皮细胞是气道的原始细胞，在维持气道湿度、通透性、气流进入、黏液排出、肺泡功能等方面发挥重要作用。COPD患者经肺泡灌洗可发现[6]，上皮细胞脱落增多，伴大量黏液和炎症因子分泌。研究证实[7-8]，HIF-1α在机体慢性缺氧、气道重塑方面扮演重要角色，早期可维持机体适应缺氧环境，但长期持续缺氧又可显著上调其表达，导致气道上皮细胞和成纤维细胞功能障碍，引起气道组织重塑，加重肺功能。同时，HIF-1α可通过多条细胞信号转导通路增加炎症介质的释放，共同影响气道组织结构。此外，MicroRNA-199a-5p属于小分子非转录mRNA，主要功能是沉默靶基因功能，进而导致相关物质的表达缺失，引起对应功能异常。部分研究指出[9-10]，MicroRNA-199a-5p在COPD、肺部感染及呼吸衰竭等疾病中表达上调，可能参与疾病的发生和预后。目前，经纤维支气管镜下肺泡灌洗技术不断成熟，适应范围不断扩大，在COPD的治疗中有确切疗效和较好的安全性[11]。因此，该研究通过对COPD患者肺泡灌洗获得上皮细胞MicroRNA-199a-5p和HIF-1α表达，探讨与疾病分期和严重程度的相关性以及两者间的表达关系，为疾病的发生机制提供参考。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2018年5月至2019年5月本院诊断COPD患者共120例，纳入标准：(1)年龄18～75岁；(2)符合COPD的诊断标准[12]；(3)有肺泡灌洗指征；(4)取得知情同意，临床资料完善。排除标准：(1)病情严重，伴意识障碍，呼吸衰竭；(2)合并肺癌、支气管扩张；(3)严重心、肝、肾等功能障碍。根据疾病发生状态分为稳定期80例，急性发作期40例，根据肺功能检测分为轻度30例，中度60例，重度30例；患者基线资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。见表1、2。

表1 不同疾病发生状态的患者基线资料比较

表2 不同肺功能的患者基线资料比较

1.2仪器与试剂 紫外分光光度计(美国赛默飞世尔公司)、荧光定量PCR 仪(美国ABI公司)、电泳仪(北京六一仪器厂)、恒温二氧化碳培养箱(美国Thermo Fisher公司)。TRIzol试剂和逆转录试剂盒(美国Invitrogen公司)、Master Mix(美国Sigma公司)。

1.3肺泡灌洗及观察指标 经肺泡灌洗获得上皮细胞，并鉴定细胞形态，然后采用实时荧光定量PCR法检测细胞MicroRNA-199a-5p和HIF-1α mRNAs表达水平，分析不同疾病分期和严重程度患者间MicroRNA-199a-5p和HIF-1α mRNAs表达的差异性，以及两者间的相关性。肺泡灌洗主要流程：入院完善相关检查，综合评估病情和操作安全性，准备抢救药品。术前禁食水，常规开放静脉通道，0.5%地卡因气道喷雾局部麻醉，评估麻醉深入，满意后取仰卧位，经鼻孔缓慢插入纤维支气管镜，确定前端位置，根据术前X线或CT成像特征，确定灌洗部位，全面了解气道解剖、支气管黏膜病变；灌洗时先采用2%利多卡因局部麻醉，分次、临近多点灌洗，经硅胶孔注入37 ℃灭菌生理盐水，总量100～250 mL，单次25～30 mL，50～100 mm Hg负压吸引回收灌洗液(回收率至水40%～60%)。及时观察患者反应，如果不耐受或出现不良反应，应及时终止操作并对症处理。取肺泡灌洗液30 mL，4 ℃ 3 500 r/min离心10 min，取下层沉淀细胞，经流式细胞仪对上皮细胞进行标记和分离，显微镜下对细胞形态进行鉴定，细胞于-80 ℃保存备用。

1.4检测方法 主要步骤：实验前配置上样缓冲液、电泳缓冲液和转膜缓冲液(根据操作步骤完成)，取样品细胞10 μg充分洗涤后加入萃取试剂TRIzol裂解液反应30 min，10 000 r/min离心10 min，重复加入TRIzol液和离心操作3次后，加入氯仿室温静置5 min，样品分成3层，RNA位于上层水相中；转移至新管，加入丙醇沉淀、离心、干燥、-80 ℃保存。经电泳分析提取RNA产物，分光光度仪测定浓度，电泳条带测定纯度，符合实验要求。然后合成cDNA作为转录模板，设计引物序列，MicroRNA-199a-5p:(F)5′-AAT TCG ATG AGG GAC CA-3′,(R)5′-TAT ATA TAC CCG GGA TAT-3′,326 bp;HIF-1α:(F)5′-ACC GGC GCG ATT TAT AT-3′,(R)5′-CCG GCA TAT ATC GCG-3′,123 bp;U6:(F)5′-GCG CGT ATA GGC GCG-3′,(R)5′-GGC GCG TTT ATA T-3′,86 bp。室温下融解PCR Mix，冰上PCR扩增，体系包括PCR Mix 10 μL+正反引物各4 μL+cDNA 1 μL，添加反应水至20 μL。反应条件位95 ℃ 10 min预变性，95 ℃ 10 s变性，60 ℃ 20 s退火扩增40次循环，72 ℃ 15 s延伸。熔解曲线分析程序为72～95 ℃升温0.5 ℃/次，恒温10 s/次，降温30 ℃ 30 s。结果以2-△△Ct法表示。

1.5统计学处理 采用SPSS20.0统计软件对数据进行分析,两组定量数据的比较采用t检验;多组定量数据的比较采用方差分析的方法,多组之间两两比较采用SNK-Q检验的方法，计数资料作χ2检验；Pearson检验分析MicroRNA-199a-5p和HIF-1α mRNAs表达水平的相关性；P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1不同分期和严重程度COPD患者上皮细胞MicroRNA-199a-5p mRNA表达水平 急性期患者上皮细胞MicroRNA-199a-5p mRNA表达水平(0.63±0.11)显著高于稳定期(0.37±0.08)，重度患者上皮细胞MicroRNA-199a-5p mRNA表达水平(0.66±0.13)高于中度患者(0.35±0.07)，中度患者上皮细胞MicroRNA-199a-5p mRNA表达水平(0.35±0.07)高于轻度患者(0.19±0.05)，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

注：#P<0.05，与稳定期比较；##P<0.05，与轻度比较；###P<0.05，与中度比较。

图1不同分期和严重程度COPD患者上皮细胞MicroRNA-199a-5p mRNA表达水平

2.2不同分期和严重程度COPD患者上皮细胞HIF-1α mRNA表达水平 急性期患者上皮细胞HIF-1α mRNA表达水平(0.52±0.13)显著高于稳定期患者(0.34±0.08)，重度患者HIF-1α mRNA表达水平(0.55±0.16)高于中度患者(0.32±0.06)，中度患者HIF-1α mRNA表达水平(0.32±0.06)高于轻度患者(0.16±0.04)，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.3上皮细胞MicroRNA-199a-5p和HIF-1α mRNAs表达水平的相关性 采用Pearson相关分析发现，MicroRNA-199a-5p和HIF-1α mRNAs表达水平在COPD稳定期和急性期患者，轻度、中度和重度患者及总体患者中均呈现较好的正相关性(P<0.05)。见表3。

表3 上皮细胞MicroRNA-199a-5p和HIF-1α mRNAs表达水平的相关性

3 讨 论

COPD的治疗应以预防为主，防治结合，COPD具有不可逆的气流受限特点，早期以气道高反应性和炎性反应为主，气道上皮细胞分泌大量黏液蛋白成分，堵塞小气道，造成吸气和换气功能下降[13]；长期发展可诱导上皮细胞功能障碍，成纤维细胞增生，进而导致气道组织重塑，气流受限不可逆，病情逐渐加重，临床治疗效果较差[14]。因此，在疾病的早期阶段进行强化干预可显著改善疾病进程，提高生活质量。目前，临床主要依赖肺功能进行疾病分级和病情进展程度判断，灵敏度有待提高。该研究通过对COPD患者气道灌洗液中起主要作用的上皮细胞功能检测，其中MicroRNA-199a-5p和HIF-1α表达来探讨疾病的发生机制。

研究结果提示，急性期患者上皮细胞MicroRNA-199a-5p和HIF-1α mRNAs表达水平显著高于稳定期，重度患者高于中度，中度患者高于轻度，差异有统计学意义(P<0.05)。MicroRNA-199a-5p是新近发现与COPD的发生有关的一种重要的非编码RNA 分子，经差异基因芯片技术筛选发现[15]，其在COPD患者中表达明显上调，与疾病严重程度密切相关。真核细胞体内存在多种非编码RNA 分子，主要与转录基因结合，调节效应基因的转录和表达。研究显示[16]，其功能可能在于调节靶细胞的增殖和凋亡活性。但是具体的作用途经还有待深入分析。HIF-1α在COPD的发生和发展阶段发挥重要作用。流行病学显示[17-18]，COPD的病死率和住院天数与气道黏液分泌量呈正相关，黏液分泌量是肺功能下降的独立预测因子，上皮细胞作为主要的分泌来源，在受到气道环境、病原微生物以及炎症信号刺激下被激活，大量分泌黏液蛋白和炎症介质，参与气道高反应性、组织重塑和COPD的病理过程。HIF-1α可调节上皮细胞对缺氧环境的耐受性，主要通过影响一氧化氮合酶基因的转录和表达来实现[19]，内皮细胞释放活性NO降低，血管持续收缩，增加了气道阻力；此外，还可以影响血管新生、促红细胞生成素的生成来调节组织氧供[20-21]。进一步发现，HIF-1α可介导PI3K信号通路活化，进而调节TGF-β和EGFR的表达，参与气道炎性反应和组织重塑[22-23]。该研究结果提示，急性期较稳定期患者MicroRNA-199a-5p和HIF-1α表达明显增加，考虑与MicroRNA-199a-5p和HIF-1α表达上调明显加重了气道炎性反应和高反应性有关；同时，重度患者高于中度，中度高于轻度，提示MicroRNA-199a-5p和HIF-1α表达可持续作用于气道上皮细胞，在疾病的发展进程中表现更加突出。

相关分析发现，MicroRNA-199a-5p和HIF-1α mRNAs表达水平在COPD稳定期和急性期患者，轻度、中度和重度患者以及总体患者中均呈现较好的正相关性。提示两者可能在COPD的发生和发展中发挥协同作用，至于两者间的内在作用机制还有待进一步探讨。

4 结 论

综上所述，COPD患者上皮细胞MicroRNA-199a-5p和HIF-1α表达上调与疾病分期和严重程度密切相关，两者可能发挥协同作用关系。下一步可通过细胞或动物模型探讨MicroRNA-199a-5p和HIF-1α的内在作用机制，为COPD的早期防治提供新靶点。