子宫内膜癌患者血清及癌组织中microRNA-195的表达水平及意义*

岳奇芳,陈 然,李 园,张雪琪,赵小萌△

(1.石家庄心脑血管病医院妇产科，河北石家庄 050000； 2.河北医科大学附属第一医院妇科，河北石家庄 050000)

随着社会人口老龄化的进展、环境污染、生活方式改变及病毒感染，国内子宫内膜癌发病率及检出率逐年上升，并呈年轻化趋势。尽管近年来子宫内膜癌的诊断和治疗水平有了很大程度的提高，但其仍然是导致女性癌性相关死亡的首要原因[1]。microRNAs也称微小RNA，是一小组内源性非编码RNA基因，能够调节基因表达，在多种真核生物的病理生理进程中发挥着重要作用[2]。目前临床学者对肿瘤的研究越来越集中在microRNAs分子上，其中microRNA-195已被证实与多种肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭、转移密切相关[3]，但关于microRNA-195在子宫内膜癌中的研究甚少，若能明确二者的关系，将有望为子宫内膜癌的分子机制及治疗方向研究提供依据。为此，本研究主要观察microRNA-195在子宫内膜癌及癌旁组织中的表达情况，并分析其与病理学指标的关系。

1 资料与方法

1.1一般资料 子宫内膜癌癌组织及对应肿瘤边缘2～5 cm处的癌旁组织来源于2018年1—4月石家庄心脑血管病医院接受子宫内膜癌分期手术治疗的60例患者(病例组)，术后病理组织学检查证实为子宫内膜癌，已排除未取得癌旁组织、未接受过放化疗或激素治疗、临床资料欠完善的患者。年龄29～55岁，平均(45.45±6.29)岁；病理类型：子宫内膜样腺癌55例，非子宫内膜样腺癌5例；国际妇产科联盟(FIGO)手术病理分期[4]：Ⅰ期18例，Ⅱ期27例，Ⅲ期15例；病理分级：G1级20例，G2级29例，G3级11例；肌层浸润深度：<1/2肌层35例，≥1/2肌层25例；雌激素受体(ER)阳性35例，孕激素受体(PR)阳性39例、原癌基因人类表皮生长因子受体2(Her-2)阳性43例。同时抽取同期入院行妇科体检的30例健康者作为对照(健康组)，年龄27～50岁，平均(44.77±8.07)岁。本研究通过了医院伦理委员会审核。

1.2仪器与试剂 TRIzol总RNA提取试剂盒(美国Invitrogen公司)；DMEM 培养基(Corning公司)；胎牛血清(FCS)由美国HyClone公司提供；Cycleave®反转录聚合酶链反应(PCR)试剂盒(日本TaKaRa公司)；梯度PCR仪(美国Bio-rad公司)；定量PCR仪(美国ABI公司)；紫外分光光度仪(北京普析通用仪器有限责任公司)；microRNA-195及内参引物均由上海生工生物公司设计合成。

1.3实时荧光定量PCR(qPCR)检测microRNA-195表达 清晨空腹时抽取各实验对象外周静脉血5 mL，加入乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝剂(上海新睿)，2 h内于4 ℃、10 000×g离心10 min，离心后提取上层血清备用。同时挑取病例组患者子宫内膜癌、癌旁组织进行研磨，加入细胞裂解液处理，并遵照TRIzol试剂说明书提取总RNA，提取的总RNA经紫外分光光度计定量。microRNA-195上游引物为 5′-CGT AGC AGC ACA GAA AT-3′，下游引物为5′-GTG CAG GGT CCG GGT-3；对照内参U6上游引物为5′-GTG CTC CCT GCT TCG GCA GCA CAT ATA C-3′，下游引物为5′-AAA AAT ATG GAA CGC TTC ACG AAT TTG-3′。qPCR总反应体系20 μL：SYBR Green PCR Master混合物10 μL，上游、下游引物各1 μL，DNA模板2.0 μL，灭菌蒸馏水6.0 μL。反应条件：预变性95 ℃ 15 min；94 ℃ 15 s；55 ℃ 30 s；72 ℃延伸30 s，75 ℃荧光收集30 s，36个循环。所有步骤均带有阳性、阴性质控。每个样本均设3个复孔，留取Ct值，结果取平均值，分别计算引物与内参的ΔCt值[ΔCT=Ct(microRNA-195)-Ct(U6)]。以2-ΔΔCt得出血清及组织子宫内膜癌及癌旁组织中microRNA-195相对表达量。

2 结 果

2.1病例组、健康组血清microRNA-195表达水平比较 与健康组[(1.32±0.40)]相比，病例组血清microRNA-195表达水平[(0.51±0.17)]明显低，差异有统计学意义(t=10.599，P<0.05)。

2.2血清microRNA-195诊断子宫内膜癌的ROC曲线分析 血清microRNA-195对诊断子宫内膜癌的ROC曲线，显示曲线下面积为0.778(95%CI：0.692～0.864)，根据最大约登指数确定血清最佳阈值为0.742，此时血清microRNA-195诊断子宫内膜癌的灵敏度、特异度分别为76.67%(46/60)、73.33%(22/30)。见图1。

图1 血清microRNA-195对诊断子宫内膜癌的ROC曲线

2.3子宫内膜癌及癌旁组织microRNA-195表达水平 与癌旁组织相比[(1.18±0.23)]，子宫内膜癌癌组织中microRNA-195相对表达量明显低[(0.45±0.19)]，差异有统计学意义(t=18.954，P<0.05)。

2.4microRNA-195表达水平与病理学指标的关系 不同的年龄、病理类型、病理分级、ER、PR表达强度的子宫内膜癌癌组织microRNA-195表达水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)；而microRNA-195表达水平Ⅰ期癌组织>Ⅱ期癌组织>Ⅲ期癌组织，浸润深度≥1/2肌层的癌组织microRNA-195表达水平明显高于浸润深度<1/2肌层的癌组织，Her-2阴性的癌组织癌组织microRNA-195表达水平明显高于Her-2阳性的癌组织，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 microRNA-195表达水平与病理学指标的关系

3 讨 论

本研究于2018年上半年取得子宫内膜癌癌组织及对应癌旁组织标本60例，并尝试从microRNAs的角度分析子宫内膜癌的病理特征，microRNAs是一类新能够调控基因表达的内源性非编码单链小分子RNA(全长为19～25 nt)，能够调节基因表达，在多种真核生物的病理生理进程中发挥着重要作用，主要通过与靶microRNAs的3′非编码区配对结合发挥作用，继而导致mRNA转录阻遏或降解。近年来，临床报道一致认为，microRNAs不但可扮演抑癌基因的角色下调原癌基因活性，而且可转变为癌基因下调抑癌基因活性[5-6]。因此，临床学者对肿瘤的研究越来越集中在microRNAs分子上，周胤健等[7]指出，采用qPCR可准确获取microRNAs的表达量，筛选获得子宫内膜癌microRNAs的差异表达谱，如microRNA-205，microRNA-200b、microRNA-216b、microRNA-15b等，均可能参与了子宫内膜癌的发生发展，并影响预后。而microRNA-195是microRNA-15/16/195/424/497家族的重要角色，最初被发现于老鼠基因，而后经过同源序列预测，证实在人类基因也存在，位于人类染色体17p13.1上。作为抑癌分子，microRNA-195可靶向调节细胞增殖相关信号通路或生物学相关蛋白，继而干扰细胞增殖相关信号生物学效应过程。目前，microRNA-195已被证实在胃癌[8]、胰腺癌[9]、直肠癌[10]、肝癌[11]等恶性肿瘤中可发挥抑癌基因作用。妇科肿瘤中，赵静[12]、SONG等[13]研究采用qPCR检测microRNA-195在宫颈癌组织和细胞中的表达水平，发现其在宫颈癌组织和细胞系中表达下调；且上调microRNA-195能够抑制宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭，提示microRNA-195是宫颈癌潜在的治疗生物标志物。但在子宫内膜癌癌组织中的表达情况鲜见报道。

本研究采用qPCR检测子宫内膜癌患者血清及癌组织、对应癌旁组织microRNA-195的相对表达量，发现与健康组相比，病例组血清microRNA-195表达水平明显低,差异有统计学意义(P<0.05)，血清microRNA-195诊断子宫内膜癌的灵敏度、特异度均高于70%。由于外周血样本易获得，且血循环microRNAs不易被RNA酶降解，故认为血清microRNAs表达可辅助诊断和鉴别诊断子宫内膜癌，具有潜在的临床应用价值。同时，与癌旁组织相比，子宫内膜癌癌组织中microRNA-195相对表达量明显低，且子宫内膜癌癌组织中microRNA-195低表达与对应患者年龄、病理类型、病理分级、ER和PR表达强度无关，而microRNA-195表达水平Ⅰ期癌组织>Ⅱ期癌组织>Ⅲ期癌组织，浸润深度≥1/2肌层的癌组织microRNA-195表达水平明显高于浸润深度<1/2肌层的癌组织，Her-2阴性的癌组织癌组织microRNA-195表达水平明显高于Her-2阳性的癌组织，提示子宫内膜癌癌组织中microRNA-195低表达与临床分期、浸润深度及Her-2表达强度密切相关。其中，Her-2原癌基因借助点突变、过量表达与扩增后可逐渐被活化，可通过多种信号途径影响肿瘤细胞增殖与侵袭，并可降低宿主防御肿瘤的能力，已被证实与子宫内膜癌进展密切相关[14]。因此，认为microRNA-195在子宫内膜癌癌组织中呈现低表达可能对子宫内膜癌的发生发展有一定促进作用，推测与microRNA-195低表达对宫颈癌进展的机制类似，即低水平microRNA-195表达不利于抑制细胞增殖，而上调表达后细胞增殖能力明显减弱，阻滞细胞周期、促进细胞凋亡可能为microRNA-195影响子宫内膜癌发生、发展的可能机制，但其具体作用机制尚不清楚，且是否影响患者预后仍需随访后补充论证。此外，microRNA-195通常分为microRNA-195-3p和microRNA-195-5p，本研究受检测条件的限制，具体何种指标对对子宫内膜癌的发生发展发挥促进作用尚未进行论证，将有待于后期深入分析。

4 结 论

microRNA-195在子宫内膜癌癌组织中呈低表达，且与子宫内膜癌的发生发展密切相关，阻滞细胞周期、促进细胞凋亡可能为其机制之一，但其具体作用机制尚不清楚，且是否影响患者预后仍需随访后补充论证。