儿童ITP外周血Th1、Th2、Th17、Treg细胞表达及临床意义*

魏佩佩 方代华

目前大量研究已证实ITP的发病与免疫因素有着密切的关系，B淋巴细胞功能异常导致抗血小板自身抗体产生，使血小板过度破坏是ITP公认的发病机制[1]。近年来，有学者指出调节性T淋巴细胞（Treg）和辅助性T淋巴细胞（Th1、Th17）以及其分泌的细胞因子失衡可能促进了免疫应答的发生和发展，在ITP的发病机制中扮演了重要的角色[2]。本文通过检测ITP患儿外周血各类T淋巴细胞表达水平，分析其在ITP发病中的作用及对临床的指导意义。

资料与方法

1 一般资料 选取2017年6月～2018年9月于我院诊断并治疗的ITP患儿46例作为病例组，年龄＜14岁，病程＜3个月，均符合《血液病诊断及疗效标准》[3]中的诊断标准。排除继发性血小板减少，有明确的感染史、疫苗接种史及毒物药物接触史，以及1个月内使用过糖皮质激素或免疫制剂的患儿。其中男性27例，女性19例，年龄22个月～9岁，平均年龄（3.8±1.5）岁，病程24～57 d，平均病程（41.7±10.2）d。另选取性别、年龄与病例组相匹配的健康儿童40例为对照组，男性22例，女性18例，年龄26个月～8岁，平均年龄（4.0±1.1）岁。两组儿童一般资料差异无统计学意义（P＞0.05）。本次研究通过了本院伦理学讨论通过。所有患儿均由监护人签署了关于本次研究的知情同意书。

2 方法

2.1 仪器与试剂：流式细胞仪（型号FACSCalibur）为美国BD公司提供，全自动血球分析仪（型号system 100i）购自日本希森美康公司，同时两个公司提供原厂试剂进行检测。人IFN-γ（批号：2017230042）、IL-4（批号:201600372）、IL-17（批号:201799392）细胞因子试剂盒由武汉博士德生物医药公司生产。

2.2 标本采集与处理：采集清晨空腹静脉血10 mL置于肝素抗凝管中，其中5 mL用于流式细胞仪测定，而其余5 mL进行细胞因子测定。Th1、Th2、Th17、Treg细胞测定：取50μL加入CD4-FITC、CD25-PE液各10 μL摇匀，于避光室温条件下孵育15 min，加固定剂15 min洗涤弃上清，加破膜剂15 min洗涤弃上清，将10 μLFoxP3-PE-Cy5单克隆抗体与其混匀，静置30 min，1 500 r/min离心，弃上清，加入200 μL PBS缓冲液并立即置入流式细胞仪进行外周血Treg细胞检测[4]。取100 μL抗凝血加入等体积1 640培养液1∶1混匀，置于加入到RPMI-1640培养体系（50ng/mLPMA工作液；1 μg/mL ionomycin；3μmol/mL monensin）于37 ℃含5%CO2条件下培养5 h，加入CD4-FITC、CD8-APC、CD3-PE-CY7单克隆抗体各10 μL，避光静置15 min，依次加固定剂、破膜剂，避光孵育15 min，PBS缓冲液洗涤1次[5]。将10 μL IFN-γ-PE-CY5、IL-17-PE、IL-2单克隆抗体与其混匀，避光孵育20 min，洗涤2次，PBS重悬细胞，置入流式细胞仪进行外周血Th1、Th2、Th17细胞检测。细胞因子测定：5 mL血液离心后分离血清后进行-80℃保存，采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测血清IFN-γ、IL-4、IL-17水平。具体步骤如下：①进行包被缓冲液稀释三种细胞因子的抗体至最适合的浓度，进行微孔板包被抗体，进行37℃水浴保持2～3小时，进行冰箱储存；②通过洗涤移除包被液体，进行三次清洗，每次5 min；③加样：分别在各个凹槽中加入血清样本50 μL，作用1 h；④小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30 秒后弃去，如此重复5 次拍干：⑤各个板孔加入二抗试剂酶标试剂，⑥进行温浴和洗涤，同时1，2步骤；⑦加入显色底物和碱性氧化剂，进行轻微震荡；⑧加入终止液后通过调节光源波长进行OD值判读，酶标仪采用郑州安图公司生产的PHOmo型号；实验的步骤严格的按照说明书进行操作。

3 统计学处理 应用SPSS 22.0对本研究数据进行分析处理，计量资料用（ ±s）表示，数据符合正态分布，组间比较采用t检验。各类T淋巴细胞与血小板变化的相关性分析采用Pearson线性相关分析，检验效能α=0.05，P＜0.05表示差异有统计学意义。

结 果

1 病例组与对照组外周血各类T淋巴细胞频数及细胞因子水平比较 病例组患儿外周血Th1细胞、Treg细胞频数比例低于对照组，Th2、Th17细胞比例高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），病例组细胞因子IFN-γ、IL-17水平高于对照组，细胞因子IL-4水平低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

2 病例组治疗前后各类T淋巴细胞频数及细胞因子水平比较 病例组治疗后患儿外周血Th1、Treg水平、血小板计数及细胞因子IL-4较治疗前升高，Th2、Th17水平及细胞因子IFN-γ、IL-17较治疗前降低，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表1 病例组与对照组外周血各类T淋巴细胞频数及细胞因子水平比较[（ ±s），pg/mL）]

表2 病例组治疗前后各类T淋巴细胞频数及细胞因子水平比较[（ ±s），pg/mL）]

3 治疗前后各类T淋巴细胞变化与血小板变化的相关性 Pearson线性相关分析结果显示，治疗前后血小板变化与外周血Treg、Th1水平呈正相关关系（r=0.461，0.383），与Th17、Th2水平呈负相关关系（r= -0.362，-0.311）。

讨 论

特发性血小板减少性紫癫（ITP）又称自身免疫性血小板减少性紫癫，是小儿最常见的出血性疾病。其主要临床特点是皮肤、粘膜自发性出血，血小板减少，出血时间延长和血块收缩不良[6]。本病多见于1～5岁儿童，发病前常有病毒感染史，但目前认为病毒感染不是导致血小板减少的直接原因，而是病毒感染后机体产生了破坏血小板的抗体引起。大量研究证实了T淋巴细胞亚群及其所产生的细胞因子参与了ITP免疫应答的诱导和发病[7]。

调节性T（Treg）细胞作为一种免疫抑制细胞参与机体免疫反应的调控，维持机体自身免疫耐受和免疫自稳。在ITP患儿外周血中，Treg细胞的减少导致T淋巴细胞活化增殖的抑制作用减弱，进而破坏免疫耐受的平衡状态。自身反应性T细胞激活识别血小板表面抗原，激活B淋巴细胞并产生多种血小板抗体[8]。根据产生的细胞因子及功能的差异，CD4+T淋巴细胞可分为Th1细胞、Th2细胞及Th17细胞[9]。Th1细胞可分泌IFN-γ、IL-2等细胞因子，具有促进各亚型T细胞活化及产生细胞因子的作用。Th2细胞分泌的IL-4可促使B淋巴细胞分泌IgE和IgG，并以自分泌的方式增强自身作用而抑制Th1细胞的增殖活化。通常情况下，Th1/Th2处于动态平衡以维持机体免疫应答的稳定性，当这种平衡被打破后便可表现为各种免疫相关性疾病[10]。目前关于ITP患者Th1/Th2的功能状态仍有争论，Gerloni M观察到成年慢性ITP患者外周血T淋巴细胞向Th1细胞转移[11]。本研究对儿童ITP患者外周血T淋巴细胞进行分析，利用流式细胞术检测PMA活化的淋巴细胞内相关因子，发现Th2细胞阳性率及相关细胞因子（IL-4）明显升高，与徐维家等人研究结果一致[12]，说明儿童ITP患者体内呈Th2过度活化状态，而通过治疗Th2细胞阳性率及IL-4水平降低，Th1及IFN-γ水平升高，Th1/Th2失衡状态及血小板破坏程度得以缓解，再次印证了T淋巴细胞各亚型失衡与儿童ITP发病及疾病状态具有密切关系。

Th17和Th22是新发现的两种T淋巴细胞亚型，Th17分泌的细胞因子（IL-17）是一种促炎因子，可加剧和放大自身免疫疾病的病理过程，在ITP中即表现为促进Th2细胞的直接细胞毒效应使血小板破坏增加[13]。本次研究显示，健康对照组及治疗后的ITP患儿外周血Th17细胞比例及IL-17水平明显低于治疗前ITP患儿，差异有统计学意义（P＜0.05）。治疗前后Th17水平变化提示Th17细胞参与了疾病的发生和发展。此外，通过治疗前后各亚型T淋巴细胞变化与血小板变化的相关分析可进一步推论出T淋巴细胞失衡在ITP疾病发生和发展中的关键作用，其中，治疗前后血小板变化与外周血Treg、Th1水平呈正相关关系（r=0.461，0.383），与Th17、Th2水平呈负相关关系（r= -0.362，-0.311）。提示Th17、Th2细胞对ITP发病起到促进作用，而Th1、Treg细胞则起到抑制作用。深入研究T淋巴细胞亚群变化与血小板计数变化及发病的关系有助于为儿童ITP提供更特异的治疗依据。

综上，外周血Th1、Th2、Th17、Treg细胞及细胞因子比例失衡与儿童ITP发病有关，通过测定外周血各类T淋巴细胞可初步判断疾病状态及血小板水平。