红细胞无效输注判定检测技术研究新进展*

袁君 王伟 李娜 栾建凤

输血是临床重要的抢救手段和治疗方式，随着分离技术的发展，成分输血已经在临床普及开来，红细胞悬液作为最为重要、用量最大的血液成分，无效输注的情况也占有很大比例，既浪费了宝贵的血液资源，又影响了患者的治疗[1]。所以，我们必须要根据患者的病情制定合理的用血计划，特别要关注输血后的效果。目前，评价红细胞输注效果的标准主要是根据血红蛋白Hb上升情况和溶血产物增加来制定的，血红蛋白未增加到预期值、溶血产物大量增加均视为红细胞输注无效。为了确保患者的输注效果，明确输注无效的原因尤为重要，红细胞输注无效的原因主要包括免疫和非免疫因素，非免疫因素包括红细胞质量、手术外伤、药物毒理、辐射化疗等，免疫因素主要包括：红细胞代谢产物、特殊血型物质、特殊抗体及其他体内免疫复合物，且由这些免疫因素引起红细胞输注无效更加难以判定。因此本文旨在为临床处理红细胞输注无效的现象并形成判定红细胞输注无效的实验规范提供理论参考和依据。

1 无效输血的定义及输血效果评价标准

1.1 无效输血的定义：按八省市无效输血协作组的试行标准，具体为输全血或红细胞制剂后24 h内，复查Hb值，若排除继续失血、输液稀释等情况，该值升高未达到预期值者则判断为无效输注[2]。

1.2 输血效果评价标准

1.2.1 血红蛋白（Hb） 升高预期值判定：由血红蛋白（Hb）是否达到预期值来直接判断输血效果。一名体重为55～65 kg、 Hb 110～130 g/L的供血者,400 mL全血中Hb应为44～52 g，同等体重的受血者每输注2单位红细胞,外周血血红蛋白至少升高10 g/L[1,3]。

其中：①输入量以全血为标准，各种红细胞制剂折算为对应原料全血量；②儿童按0.09 L/kg计算；③90%为检验误差。

1.2.2 游离血红蛋白及胆红素的测定：通过判定是否存在溶血产物而间接判定输血效果的方法。当血管内发生溶血时，红细胞被破坏，其中的血红蛋白释放到血液中，血浆游离血红蛋白会明显升高，严重者可见血红蛋白尿。血红蛋白进一步被单核吞噬系统吞噬处理，分解为游离胆红素、直接胆红素、总胆红素，故游离血红蛋白和胆红素可间接反映红细胞输注无效的程度，其中游离胆红素最先升高[4]。

2 红细胞无效输注的判定试验 红细胞输注无效是一种由于免疫因素或非免疫因素引起红细胞破坏过多，可造成机体发生溶血反应，使得溶血产物增加、血红蛋白无法升高到预期值的现象，因此，溶血成为判断红细胞输注无效发生的主要特征。实验室判定试验根据造成溶血的原因可归为三类，一是检测红细胞代谢产物，如含铁血黄素、胆红素、触珠蛋白等；二是检测特殊血型，如ABO亚型抗体、非ABO亚型抗体筛查等；三是相关免疫物质如特殊抗体等。

2.1 红细胞代谢产物测定试验

2.1.1 含铁血黄素检测试验：血管内溶血时，逸出的红细胞被巨噬细胞吞噬并降解，产物Fe3+可与蛋白质结合成为粗大的棕黄色铁蛋白颗粒，即含铁血黄素。组织内出血时游离血红蛋白经肾脏排出，并被肾小管上皮重吸收，而当大量红细胞被破坏时，肾小管上皮细胞无法完全清除游离血红蛋白，含铁血黄素即随尿液排出[5]。含铁血黄素是一种含铁质的棕色色素，利用HE染色法染色后镜下观察呈棕黄色具有折光型的粗大颗粒，而利用普鲁士蓝染色法即酸性条件下，亚铁氰化钾溶液使Fe3+从蛋白质中分离出来，与亚铁氰化钾反应，生成蓝色化合物[6]。正常人呈阴性，有分散或成堆蓝色闪光颗粒(直径1～3 μm)即为阳性，提示为血管内溶血。

2.1.2 血浆结合珠蛋白试验：结合珠蛋白又称触珠蛋白，是血清α2球蛋白中的一种酸性糖蛋白，与游离血红蛋白形成Hp-Hb复合物，将Hb运送至肝脏代谢，以避免Hb对肾脏的损伤。当游离血红蛋白产生过多时，结合珠蛋白被利用过多，使得血浆中的含量减少，是血管内溶血的敏感性指标。触珠蛋白的量可通过流式细胞术和双抗体夹心法酶联免疫吸附实验（ELISA）检测[7]。红细胞大量破坏时，Hp浓度降低，提示机体发生溶血反应。

2.1.3 血红蛋白尿：血红蛋白在红细胞中起到携氧的作用，正常尿液中是没有血红蛋白的，但是当发生血管内溶血时，血浆中血红蛋白浓度增高超过了结合珠蛋白的结合能力，使得血浆游离血红蛋白增多，超过肾脏滤过和重吸收能力后即发生血红蛋白尿[8,9]。显微镜镜检是直接对尿液沉渣进行红细胞计数。干化学法利用过氧化氢使血红蛋白中的血红素氧化呈色，通过尿液分析仪分析检测[10]。免疫胶体金法利用单克隆和多克隆抗体特异的与人血红蛋白发生显色反应，具有较高的灵敏度且特异性高，结果稳定，阳性率高[11]。镜检阳性、尿液分析仪血红蛋白值升高或胶体金法阳性即提示溶血。

2.1.4 胆红素测定：红细胞死亡或破坏后，胆红素被释放经肝脏代谢经肠道排出。而当红细胞破坏过多时，肝脏无法完全清除胆红素使血液中胆红素含量增高[12,13]。重氮法是利用胆红素可在加速剂的作用下与重氮苯磺酸发生显色反应，加入终止剂后使反应物变为蓝色，利用分光光度计读取并计算数值[14]。胆红素氧化酶法是指在不同pH环境中，胆红素氧化酶可将胆红素氧化成胆绿素继续被氧化成淡紫色物质，分光光度计进行检测。经皮胆红素测定法是利用皮下组织中胆红素和血红蛋白对光波吸收的原理经皮肤检测[15，16]；高效液相色谱法可利用胆红素各组分保留时间及吸收光谱不同对胆红素各种成分进行测定。质谱分析法则是结合分子质量、分子结构和解离电荷特性来分析并完成检测，质谱法检测准确、特异，但是还不能够检测出胆红素的Bd（δ-胆红素）成分[17]。胆红素值升高即为有溶血现象发生。

2.2 特殊血型测定

2.2.1 ABO亚型抗体：ABO亚型主要表现为抗原的减弱或者存在ABO不规则抗体，在血型血清学检测中容易漏检造成血型的误定，使患者发生红细胞输注无效以及严重的输血反应。血清学方法是利用抗原抗体特异性反应产生肉眼可见的凝集现象[18]，方法简便、快速，但是由于灵敏度低、操作的标准化程度低等，仅仅凭借血清学方法可能无法准确的判断血型。分子生物学检测技术是利用突变的核苷酸序列来判定血型，该技术可以弥补血清学的不足之处，但是基因鉴定ABO血型多是以单核苷酸多态性为基础的，而同一种亚型对应多种基因型，单一位点的核苷酸多态性无法反应整个ABO基因所携带的信息，这就要求核苷酸多态性位点必须与ABO的基因型具有较高的相关性，另外，A、B抗原的表达依赖于其共同的前体物质H，H抗原的表达依赖于FUT1基因，当FUT1基因异常时，H抗原减弱或者缺失，导致无法正常表达A、B抗原[19]。所以，利用基因全序列检测结合血清学检测的方法才能确定血型是否误定，抗原是否漏检[20]。血清学方法出现凝集反应或基因检测出相应的核苷酸序列即为存在特殊血型抗体，从而造成溶血反应。

2.2.2 非ABO血型抗体：不规则抗体是指抗-A、抗-B以外的血型抗体，分为IgG和IgM类。这些抗体会影响血型鉴定、交叉配血、红细胞输注效果，甚至会引起严重的输血反应。目前，检测方法包括盐水法、酶介质法、抗人球蛋白法、凝聚胺法以及微柱凝胶法等[21]。盐水法只能检测出IgM类不规则抗体，而IgG类由于分子量较小无法肉眼观察；酶介质法对Rh，Kidd系统抗原较敏感，但会破坏MNSs系统，易造成此系统不规则抗体漏检，且酶不稳定，容易失活，此法不适合大规模献血员的筛查；抗人球蛋白法敏感性高、特异性强且凝集反应明显，但操作过于繁琐；凝聚胺法对Rh系统不规则抗体的检出具有很高的灵敏度，但是对于其他系统的检测敏感性差，低浓度抗体易漏检；微柱凝胶法操作简便、重复性好、准确度高，但需要孵育箱和离心机[22]。

2.3 相关免疫物质检测

2.3.1 调节性T细胞和T淋巴细胞亚群：有研究表明异体输血主要抑制T细胞免疫活性，并指出具有抑制T细胞免疫活性的调节性T细胞亚群CD4+CD25+Treg在免疫细胞功能及自身免疫耐受和移植中都发挥着重要的作用，红细胞输注无效患者输血后检查外周血CD3+T细胞和CD3+CD4+T细胞明显增加，而CD4+CD25+Treg较输血前明显下降，这说明红细胞输注无效患者输血后出现免疫系统过度活化现象，加之调节性T细胞减少，不能有效抑制这种活化现象，使红细胞加速破坏[23]。ELISA法利用酶标记抗原或抗体，与相应的抗体或抗原发生特异性反应，加入底物后被酶催化发生显色反应，可根据颜色深浅对检测物质定量。流式细胞技术将荧光染料结合于单克隆抗体上并与相应的抗原发生特异性反应后在激光照射后，抗原抗体复合物就会发出不同光谱的继发荧光，荧光量转化为电信号，即为抗原量，该技术检测时间短、敏感度高，较低量也能够检出，但是价格较高[4]。CD4+CD25+Treg明显下降，提示输血后患者免疫系统过度活化，红细胞破坏增加。

2.3.2 IgG亚型检测：IgG是血清中最主要的抗体类型，约占血清总免疫球蛋白的75%-80%，发挥着重要的免疫学效应。人类IgG分为IgG1、IgG2、IgG3和IgG4四种亚型，分别占血清中的60%-70%，15%-20%，5%-10%，＜5%，不同的亚型对相对应的Fc受体的亲和力不同。巨噬细胞通过FcRII和FcRIII识别致敏红细胞，IgG1、IgG3对FcRIII结合能力较强，且IgG3更强，故IgG1和IgG3更易引起红细胞破裂。检测IgG1、IgG3含量ELISA法利用包被有抗人IgG亚型的单克隆抗体固相微孔板来捕捉血清中相应的IgG亚型，再用辣根过氧化物酶标记的单克隆抗人IgG抗体检测结合于微孔板上的IgG亚型，加入底物后读取OD值，利用标准曲线计算IgG亚型含量,但操作复杂，相关试剂较昂贵。微柱凝胶法将抗原抗体特异性反应与分子筛技术相结合，当受检者红细胞与相应的IgG亚型单抗发生反应经离心后，无法通过凝胶间隙而被留在凝胶上部或者分散在中间，此法灵敏度高，操作简便，反应时间短，实用性强[24]。ELISA法测定IgG1、IgG3含量或者微柱凝胶法根据凝集强弱判断IgG1、IgG3含量升高即存在此类亚型，使得机体发生溶血反应。

2.3.3 总溶血补体(CH50)水平：补体是一种存在于人和动物血清中的具有酶活性的蛋白质，在机体受到刺激后可被激活，影响其免疫调节功能。经典方法是利用致敏的绵羊红细胞在检测者的血清中将补体激活，使绵羊红细胞溶血，溶血程度与补体数量和功能相关，当50%溶血状态时，溶血对补体活性变化最敏感，即用50%的溶血程度反应补体活性，经典溶血法是一种能够准确、敏感的反应补体功能的实验，但是要求致敏的绵羊红细胞必须是新鲜的，且耗时长。目前临床最常用脂质体免疫法检测补体活性，脂质体包裹有葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和对氨基苯酚，在血清中补体被激活后，脂质体被破坏释放出G-6-PDH，该物质可与底物发生显色反应，利用酶标检测仪在340 nm处读取吸光度根据标准曲线计算补体活性，脂质体免疫检测法以其操作简便，快速，不需致敏绵羊红细胞，影响因素小，可自动化分析的特点已经逐步运用于临床[25]。发生溶血反应即过度激活补体系统，补体成分消耗过多，血清中补体活性下降。

2.3.4 HLA抗体：HLA抗原广泛存在于有核红细胞表面，当输注全血、红细胞悬液、血小板等血液成分时都有可能发生HLA不合导致的非溶血性输血反应，造成输血效果不佳的情况，并且HLA抗体的产生与输血次数相关，有研究表明反复输血的患者产生HLA的频率可达到50%。补体依赖细胞毒实验即待检血清中的抗-HLA能够与淋巴细胞上的HLA抗原相结合，进一步激活补体级联反应使淋巴细胞死亡，通过染色观察细胞的死亡情况以确定相应抗原或抗体。ELISA法是样本血清与包被抗原反应后与带有酶标记的二抗反应，在显色剂的作用下发生颜色反应，颜色与待检物质呈正比，根据标准曲线得到相应数值。流式细胞术是将HLA抗原包被在不同磁珠表面，待检血清中若有与此抗原结合的特异性抗-HLA，则抗原抗体复合物继续与荧光标记的二抗反应用流式细胞仪检测。基因分型技术近年来也发展迅速，通过HLA核苷酸序列测定法、液相芯片技术等来实现[26]。ELISA阳性、流式检测到相应细胞群或基因检测到相关序列即提示有溶血反应发生。

3 红细胞输注无效检测新技术

3.1 荧光探针法检测NO水平：NO是一种不稳定的生物自由基，除了能够保持红细胞变形性、减少红细胞凋亡以外，在血液循环系统中发挥着重要的生理作用，包括松弛血管平滑肌，扩张微小血管；神经递质作用和介导细胞免疫反应三大作用[27]。当红细胞破坏过多，血浆内游离血红蛋白含量增加，使得机体内NO减少，从而降低血管内皮中的NO利用率，造成内皮功能障碍，血小板及凝血因子活化等现象的发生。NO目前选择用NO荧光探针法检测其荧光强度[28]。NO表达量减少可提示发生溶血。

3.2 单核细胞单层实验：在国外已作为临床诊断新生儿溶血病的一个常规辅助诊疗手段，此法是通过体外单核细胞吞噬抗体致敏后的红细胞的情况来检测病人血浆中是否存在使红细胞破坏的抗体，并且可预估该抗体在体内引起溶血程度的强弱。模拟体内致敏红细胞免疫过程的MMA实验更准确的反映了体内红细胞被破坏的程度，且能够预测和分析体内的溶血情况，但是操作较复杂[29]。油镜下观察200～600个单核细胞，计数发生吞噬和粘附的单核细胞，计算其占单核细胞总数的百分比PI值和阳性对照的PI值，当样品的PI值和阳性对照的PI值之比≥5%时提示可能发生溶血反应，而≤5%时则说明发生溶血反应的可能性较小。

4 结语 红细胞的输注无效应与红细胞输注的不良反应引起人们同样的关注，而了解引起输注无效的原因更是解决发生此现象的重中之重。无效输注的标准早已制定，但是相关原因的判定试验却未曾报道，对红细胞代谢产物、特殊血型、相关免疫物质三个方面的检测判定试验进行总结，并提出能够反映输注无效的新指标，希望能够形成一套无效输注的鉴定方法，并据此找出此现象发生的原因，帮助患者提高输注效果。本文综述了几个用于判定无效输注的直接或间接相关指标，而如何用于评估无效输注现象目前并未达成共识，因此仍需要大样本的临床研究来进一步证实上述指标对无效输注判定的准确性和有效性，再次筛选、优选出更客观的判定指标。近年来，随着红细胞储存损伤、红细胞免疫等研究的不断深入，加上临床患者复杂的病理生理状态，如何针对不同病人选择相应的实验或指标进行无效输注的判定，如何针对无效输注的原因进行临床干预并制定精准输血治疗方案，这将是我们继续研究和探讨的方向，以期为临床提供处理红细胞无效输注合理的、规范的流程，并指导临床合理、科学和安全用血。