APP下载

血小板输注无效患者体内C1q-HLA抗体的临床意义

2020-04-20李冬妹王洁敬媛媛单小燕贾延军

临床输血与检验 2020年2期
关键词:供者交叉试剂盒

李冬妹 王洁 敬媛媛 单小燕 贾延军

除了血小板本身的质量、临床因素(血小板量过少、质量低下、保存不当等)、患者有发热感染、脾肿大、DIC及药物作用等原因以外[1],免疫学因素也是导致血小板输注无效(platelet transfusion refractoriness, PTR)的主要原因[2],这些因素主要是指血小板输注无效患者体内存在HLA(human leukocyte antigen)抗体和/或HPA(human platelet antigen)抗体。据文献报道,反复输注血小板的患者中有30%~70%会发生血小板输注无效[3],其中免疫学因素大约占到20%~30%[4,5]。

目前,对于发生了输注无效且血小板抗体(包括HLA和HPA抗体)阳性的患者来说,需要对其进行交叉配血试验以提供相合的血小板。但我们发现,有许多PTR患者,尤其是高致敏患者,往往难以找到相合的血小板。ELISA方法检测出的抗体是HLA IgG总抗体,包括补体结合抗体和非补体结合抗体,补体结合抗体在细胞毒作用中是真正能固定补体并结合于血小板表面的破坏性抗体,而非补体结合抗体并不会导致血小板的破坏。有文献报道,细胞毒抗体(即能与补体结合并产生细胞毒作用的抗体)在心脏移植和肾移植排斥中的作用比非补体结合抗体的作用更大[6-8]。另外,斯坦福大学的一篇文章也初步显示,检测能结合C1q补体成分的HLA抗体的单抗原磁珠(C1q-SAB)方法比检测总IgG的单抗原磁珠(IgGSAB)方法能更好的检测出临床相关HLA抗体,其阳性患者通过交叉配血输注血小板后能获得更好的CCI值[9]。

因此,本项研究拟通过C1q-HLA抗体(即能结合补体成分C1q的HLA抗体)检测技术把能固定补体、激活补体级联反应从而破坏血小板的HLA抗体检测出来,并为这些患者提供特配血小板,观察输注后的临床效果,分析C1q-HLA抗体在血小板输注无效中的作用,评估C1q-HLA抗体检测技术应用在血小板输注无效患者的检测中是否有其可行性。

材料与方法

1 研究对象 收集临床送检的血小板输注无效患者的血液样本,这些患者都是因为血小板输注无效而申请在血液中心进行血小板抗体检测的,其中大部分患者都患有血液系统疾病,并且都有多次输血历史,包括血小板输注。疾病包括急性髓性白血病(acute myeloid leukemia,AML)、慢性髓性白血病(chronic myeloid leukemia,CML)、急性淋巴性白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)、慢性淋巴性白血病(chronic lymphoblastic leukemia,CLL)、多发性骨髓瘤(myelodysplastic syndrome,MDS)、再生障碍性贫血(severe aplastic anemia,SAA)、原发性血小板减少性紫癜(idiopathic thrombocytopenic purpura,ITP)等。

2 ELISA方法检测血小板抗体 固相酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒(Gen-Probe Incorporated,Waukesha, WI, USA)用于筛选患者血清中的HLA抗体(主要是抗HLA-I类抗体)和HPA抗体(血小板糖蛋白GPIb/IX、GPIIb/IIIa、GP Ia/IIa和GPIV),按照厂家说明书进行操作,结果用酶联仪检测(Thermo SCIENTIFIC, Hudson, NH, USA)。

3 LSA抗体和C1q抗体的检测 利用单抗原磁珠(LABScreenTMSingle Antigen, One Lambda,Inc, Canoga Park, CA)和C1q抗体检测试剂盒(C1qScreenTM, One Lambda, Inc, Canoga Park,CA)对ELISA方法检测到的HLA抗体阳性的患者血清标本进行进一步的检测,其中LABScreenTM Single Antigen试剂盒可用于检测患者血清中的HLA-I类和-II类抗体,C1qScreenTM试剂盒可用于检测能结合补体成分C1q的HLA抗体。两种试剂盒的操作方法相同,具体步骤按照厂家说明书进行操作。简言之,取每个患者的待检血清20 μL加入到96孔板内,然后加入5 μL磁珠,室温下避光孵育30 min,然后用缓冲液洗涤三次,加入100 μL用LPE标记的羊抗人IgG二抗,室温避光保存30 min,洗涤后用LABScan 100流式细胞仪(One Lambda, Inc.)进行检测,试验结果用HLA Fusion 3.0软件(One Lambda, Inc.)进行分析。

4 血小板交叉配血 利用单克隆抗体固相血小板抗体检测试剂盒(MASPAT kit, Sanquin, Netherlands)进行血小板交叉配血,步骤如下:取4份供者血小板,稀释后固定于96孔板内,加入患者血清室温孵育30 min;洗去未结合抗体,然后加入指示红细胞,室温孵育30 min后观察结果。挑取配型相合的血小板提供给患者。分别收集患者输注血小板前后的血小板计数值,计算1 h校正计数增加值(corrected count increment, CCI),其计算公式如下[10]:

5 统计学处理 样本特征用描述性数据如频率和百分率表示。Fisher精确检验用于比较分类变量。t检验用于分析连续变量。所有检验都应用Graph-Pad Prism 5.0软件完成(GraphPad, La Jolla, CA)。

结 果

1 40例血小板输注无效患者的基本特征 研究共收集了40例经ELISA方法检测确认为HLA抗体阳性的血小板输注无效患者的血清样本及其临床数据,包括年龄、性别、血型、所患疾病种类及其C1q抗体状态,入组患者包括13位男性和27位女性,其平均年龄为(46±22)岁,其中C1q-HLA抗体阳性患者的平均年龄为(48±22)岁。如表1所示,不同血型、不同疾病之间比较,其C1q-HLA抗体的发生率差异无统计学意义,P>0.05,见表1。

表1 入组患者及C1q-HLA抗体阳性患者的ABO血型分布及疾病类型

2 HPA抗体阳性患者血清中HPA的特异性 选择的40例患者,都是通过固相酶联免疫吸附(ELISA)方法确定为HLA或HPA抗体阳性的患者,其中有10例患者的血清中包含HPA抗体,占免疫性输注无效的25%,这个结果与文献报道基本一致[11]。本研究中检测到HPA抗体主要是针对糖蛋白GP IIB/III的见表2。此外,有2例患者血清中包含两种HPA抗体,分别是抗-GPIIb/IIIa和抗-Ib/IX抗体。

表2 HPA抗体阳性患者中抗血小板糖蛋白的特异性

3 40例血清样本中LSA和C1q HLA抗体的状态 我们分别采用One Lambda公司的LABScreen ® Single Antigen(LSA)试剂盒和C1qScreen™试剂盒对这40份血清进行了LSA抗体和C1q-HLA抗体检测,测定了其群体反应性抗体(PRA)的比例和抗体强度。结果显示,40例血清样本中有1例LSA阴性,在所有39例LSA阳性的血清样本中,C1q-HLA抗体阳性的占28例,阴性的占11例。我们根据不同的LSA和C1q-HLA抗体状态,比较了其群体反应性抗体百分率(PRA%)和抗体的强度(Max MFI),结果如图1A和1B所示,LSA抗体阳性的患者其PRA%和Max MFI明显高于C1q-HLA抗体阳性的患者,说明用单抗原磁珠检测到的HLA抗体中有相当一部分抗体是非补体结合抗体,不是C1q-HLA抗体。

4 C1q-HLA抗体与交叉配血相合血小板输注后CCI指数 本研究中40例HLA抗体阳性患者,只收集到了其中20人份的血小板输注后CCI数据。根据血清中是否含有C1q-HLA抗体,我们比较了C1q-HLA抗体阳性和阴性患者输注交叉配血相合血小板后的CCI数据(图2),结果前者平均值为(13.11±9.07)×109,后者平均值为(6.68±3.86)×109。虽然C1q-HLA抗体阳性患者CCI值稍高于阴性患者,但两者之间没有显著性差异。

图1 血小板输注无效患者血清中LSA抗体和C1q-HLA抗体的PRA%和抗体强度(Max MFI) (数据表示为平均值±标准差;LSA抗体阳性患者数=39,C1q-HLA抗体阳性患者数=28)

图2 C1q-HLA抗体组和C1q-HLA抗体阴性组的血小板输注后1小时CCI(数据表示为平均值±标准差; C1q-HLA抗体阳性患者数=13;C1q-HLA抗体阴性患者数=7)

5 不同HLA抗体状态对患者交叉配血找到相合血小板难易程度的影响 实验室为HLA抗体阳性的患者进行交叉配血以寻找匹配的血小板,为了解不同HLA抗体状态对患者交叉配血找到相合血小板难易程度的影响,我们统计了这40例患者历次的交叉配血情况,根据不同的LSA和C1q-HLA抗体状态,比较其相合供者百分比(是指交叉配血相合供者数占配血供者总数的百分比),其结果列于图3中,C1q-HLA抗体阳性患者与阴性患者之间、以及C1q-HLA抗体阳性或阴性患者与LSA抗体阳性患者之间的相合供者百分率没有相显著性差异,说明抗体的状态并不影响寻找相合血小板的难度。

讨 论

图3 LSA抗体组、C1q-HLA抗体组和C1q-HLA抗体阴性组的血小板相合供者百分率

在本研究中,我们分别利用ELISA方法和Luminex平台检测了血小板输注无效患者血清中的HLA抗体和HPA抗体,并确定了这些HLA抗体是否能够结合C1q补体。目的是为了分析C1q-HLA抗体在血小板输注无效中的作用,评估C1q-HLA抗体是否与血小板的输注疗效更相关。结果发现,尽管这些HLA抗体中有一部分是可以结合补体成分C1q的抗体,但是其与非补体结合抗体相比,血小板输注后的CCI值并没有显著性的差异,说明C1q-HLA抗体与血小板输注疗效可能不具有明确的相关性。这与以前的报道不一致,Fontaine MJ 等研究了13例高致敏的血小板输注无效患者[9],他们发现,与C1q不相合的血小板输注相比,C1q相合的血小板输注后可以得到更好的CCI值,因此他们认为C1q-HLA抗体可能具有更高的临床相关性。然而,一项TRAP研究显示[12],C1q结合的HLA-I类抗体的水平在血小板输注无效患者和非输注无效患者之间没有显著性差异,并且C1q结合抗体与CCI值之间也没有明显的相关性,这个研究的结果是与我们一致的。由此看出,C1q-HLA抗体的临床相关性还需要得到更多的数据支持,是否需要为血小板输注无效患者检测C1q-HLA抗体也有待于进一步的临床研究。

针对同种免疫性血小板输注无效患者的管理一般采取两种方法,一是从已经进行HLA/HPA分型的机采血小板供者库中选择HLA/HPA相合的血小板供者;二是进行血小板交叉配血以选择相合的血小板。交叉配血虽简单易行,对于那些高致敏患者来说,往往难以找到相合的血小板。另外,即使找到了交叉配血相合的血小板,输注后也有20%~30%的患者血小板计数值未达到预期值。因此,建立规模合适的血小板库,为需要长期输注血小板的患者提供HLA/HPA相合的血小板,是一种最佳的策略,因为这样不仅可以提高血小板输注无效患者的输注效果,更重要的是,如果在开始时就输注HLA/HPA相合的血小板,就能够在很大程度上避免血小板输注无效的发生,这将大大减少血小板的输注量,在中国目前紧张的血液供应形势下节约宝贵的血小板资源。而建立血小板库必须要考虑库容量的大小,由于HLA系统和HPA系统、尤其是HLA系统具有复杂的多态性,只有了解了血小板输注无效患者的HLA和HPA抗体的分布情况及其特异性,才能为建立规模合适的血小板库提供依据。目前国内已有多个血液中心建立了规模不等的血小板供者库,其中包括广州、上海、青岛等,通过临床应用,取得了一定的社会效益。在2012年之前,上海市血小板供者库就已经接受了80人次的患者查询,共有78名患者找到合适的供者,其中50名患者接受了单采血小板的同型(或配合型)输注,47名输注有效(24 h血小板回收率>20%),其中更有15名患者同型输注疗效明显,24 h回收率>80%[13]。青岛市血液中心采用PCR-SSO和PCR-SSP法对青岛地区无偿机采血小板捐献者1800人进行HLA-I类(A、B位点)、HPA-1、-2、-3、-4、-5、-15基因分型,建立了已知HLA和HPA分型的无偿机采血小板供者库并用于解决血小板输注无效患者的血小板输注,1 800名的血小板供者库可以使99%的患者在库中找到至少1例HLA完全相合的供者[14]。本研究分析了北京地区血小板输注无效患者体内的相关抗体、确定了其特异性,了解了同种免疫性血小板输注无效相关抗体的总体分布情况,这将为在北京地区构建血小板库提供实验数据和理论依据。

总之,本研究通过对同种免疫性血小板输注无效患者补体结合和非补体结合HLA抗体及HPA抗体特异性的检测,确定了北京地区血小板输注无效患者体内同种免疫性抗体的总体分布情况,为以后建立血小板库提供了理论依据。初步研究结果显示C1q-HLA抗体是否存在对于血小板输注的疗效并没有直接的相关性,也不会增加患者寻找到相合血小板的难度。

猜你喜欢

供者交叉试剂盒
心理护理干预对首次干细胞捐献者不良反应预防作用的效果分析
农药残留快速检测试剂盒的制备方法及其应用研究
“六法”巧解分式方程
试剂盒法制备细胞块的效果及其技术要点
老年活体供肾风险及移植肾疗效综述
亲属活体肾移植供者心理问题分析与干预
基于CLSI-M43国际标准改良的Mycoview-AST试剂盒检测性能评估
连数
连一连
EV71-CA16肠道病毒荧光定量RT-PCR诊断试剂盒的研制