PASM-Masson套染在肾穿刺活检中的应用

喻 宏，孙 炎，李晓星，苟继周，罗伟仁

肾穿刺活检组织病理诊断是肾脏疾病诊断以及鉴别的重要方法，包括常规HE染色、特殊染色、免疫荧光染色及电镜检查等。其中，特殊染色是肾穿刺活检组织的重要辅助检查方法，主要包括PAS染色、PASM染色、Masson染色以及刚果红染色等。在日常工作中，如果对穿刺肾组织分别进行染色，所需时间长，工作量大，不利于病理医师镜下观察免疫复合物沉积及其位置[1]。相反，PASM-Masson套染能够在同一张切片中准确显示病变肾小球内各种免疫复合物的形态与定位，明显缩短了染色时间，提高了工作效率，对诊断肾小球疾病起重要作用[2]。

1 材料与方法

1.1 材料收集2018年1～12月深圳市第三人民医院(南方科技大学第二附属医院)病理科存档的肾穿刺活检标本109例，组织均经10%中性福尔马林固定(pH 7.0)，固定时间12～24 h。常规脱水、透明、石蜡包埋后，切片。切片厚1.5 μm，70 ℃烤箱烤片40 min。

1.2 试剂Bouin固定液(饱和苦味酸 ∶甲醛 ∶冰醋酸=15 ∶5 ∶1)，购自广州凯秀贸易公司。Masson试剂盒(包括铁苏木精、丽春红酸性品红工作液、苯胺蓝、磷钼酸)，购自广州维格斯公司。六胺银染色试剂盒(高碘酸、硼砂溶液、硝酸银六次甲基四胺粉剂)，购自珠海贝索(BASO)公司。

1.3 染色方法将肾穿刺组织石蜡包埋后，1.5 μm厚切片，70 ℃烤片40 min。切片入二甲苯脱蜡梯度乙醇入水，1%高碘酸氧化30 min，蒸馏水冲洗。切片置于六胺银工作液35 min(60 ℃水浴箱孵育)，观察切片呈金黄色，终止染色，蒸馏水冲洗。0.1%氯化金脱色数秒，镜下观察至金黄色消失，基膜呈明显黑色，蒸馏水冲洗。3%硫代硫酸钠定影1 min，蒸馏水冲洗。Bouin液补充固定(37 ℃水浴箱4 h)。铁苏木精15 min，热水蓝化30 s。蒸馏水冲洗，Masson液30 min，蒸馏水冲洗。1%磷钼酸分化5 min，不用水洗，直接甩掉磷钼酸后加入1%苯胺蓝5 min。蒸馏水冲洗，加入1%醋酸分化2 min。高浓度乙醇梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。

2 结果

PASM-Masson套染结果显示，切片背景干净，结构清晰，肾小球基膜、肾小管基膜和毛细血管基膜均呈黑色或棕黑色，细胞间质以及胶原纤维呈蓝黑色，红细胞、肾小管上皮细胞及免疫复合物呈红色(图1、2)。

图1 膜性肾小球肾炎(3期)：肾小球毛细血管袢基膜外侧见大量“钉突”形成(箭头)；基膜呈黑色，免疫复合物“钉突”呈红色

图2 糖尿病肾病：毛细血管基膜呈黑色，系膜细胞间质以及胶原纤维增生呈蓝黑色(箭头)

3 讨论

特殊染色是鉴别肾脏疾病，显示肾组织内某些特殊成分的重要方法[3]。PASM染色法主要是观察肾穿刺组织中肾小球基膜、毛细血管袢基膜的病变程度，Masson染色主要是观察肾小球内免疫复合物沉积、系膜基质、基膜及肾间质胶原纤维增生程度。在临床工作中发现，如仅单独对肾穿刺组织进行PASM染色或Masson染色，很难对基膜病变与免疫复合物病变进行准确定位，不利于判断两者是否存在于同一部位。PASM-Masson套染既可以显示肾小球毛细血管和肾小囊基膜在炎性损伤中的改变细节，也可以观察免疫复合物的沉积[4]。实际操作中常规的六胺银染色背景过深，Masson染色对肾小球内的免疫复合物显色淡，基膜和胶原纤维对比不清晰。我科通过采取延长高碘酸氧化时间至30 min，充分暴露基膜内黏多糖中的醛基，加深金属银的显色对比度；之后Masson染色用Bouins液补充固定，一方面固定液中的苦味酸可软化过硬的纤维组织，使丽春红等大分子染料能穿透进入，另一方面使之pH环境降低，让胶原纤维、红细胞、免疫复合物着色鲜艳，与基膜着色对比清晰。

作者在实际工作中发现，切片厚度以1～1.5 μm效果最好。切片太厚(3 μm以上)，不宜观察基膜病变的组织和结构，如肾小球结构不清楚，“钉突”病变结构显示变得模糊。在PASM-Masson套染过程中，Bouins液、六胺银工作液及Masson液温度可自行调节，浸染效果更方便把控。此外，需控制PASM工作液和Masson液染色时间，每个步骤结束均需镜下观察染色程度及时进行调节。如PASM染色需要微镜下观察到肾小球基膜的着色，背景无明显着色即可终止。不宜着色过深，否则会影响后续的染色并人为增加基膜的非特异性着色。另外，高浓度乙醇脱水耗时较少，耗时较多则会导致Masson脱色。Masson染色浅染或过染均可以原步骤返回重新染色。

经本科室改良的PASM-Masson套染，对病变定位准确、背景清晰，对比明显，有利于病理医师观察肾小球基膜病变及免疫复合物的定位。此外，套染方法快速、简便，可以减少染色时间，提高工作效率，具有一定的临床诊断应用价值。