甲状腺乳头状癌中TZAP的表达及与临床病理特征的关系

杨 帆，申国文，周 晨，杨 扬，段晶玲，肖胜军，张小玲

甲状腺癌是最常见的内分泌肿瘤，2018年全球甲状腺癌发病人数约56.7万，约占所有癌症发病的3%[1]。甲状腺癌的主要组织学类型包括乳头状癌、滤泡癌、髓样癌和未 分化癌[2]，其中乳头状癌发病率最高，占所有甲状腺癌的70%以上[3]。近年甲状腺癌发生率在全球范围内快速上升[4]。

端粒锌指相关蛋白(telomeric zinc finger-associated protein, TZAP)是由ZBTB48基因编码的蛋白。TZAP蛋白通过直接结合端粒DNA双链的TTAGGG重复序列，负性调控端粒长度，诱导细胞衰老[5]。此外，TZAP还可以发挥转录因子的功能，促进p14ARF的表达，进而抑制细胞增殖[6]。TZAP与端粒相关疾病密切相关，然而在肿瘤中的研究鲜见报道[7]。本文采用免疫组化EnVision法检测甲状腺乳头状癌及癌旁正常组织中TZAP的表达，并分析其与临床病理特征的关系，探讨TZAP在甲状腺乳头状癌发生、发展中的作用及其临床意义。

1 材料与方法

1.1 材料收集2015年1月～2017年12月桂林医学院第二附属医院存档的71例甲状腺乳头状癌组织纳入观察，纳入条件：取患者未行放、化疗及免疫治疗时的手术切除标本；术后病理确诊为甲状腺乳头状癌，不考虑肿瘤大小或是否转移；本实验经桂林医学院附属医院伦理委员会批准，患者及家属知情并签署同意书。排除标准：临床资料不完整者；合并其他恶性肿瘤、自身免疫性疾病等。

1.2 免疫组化采用免疫组化EnVision法染色，手术标本经石蜡包埋，4 μm厚切片，二甲苯脱蜡至水，流水冲洗10 min，柠檬酸盐缓冲液高温高压修复3 min，室温下自然冷却后，3%双氧水孵育10 min，PBS冲洗3次×3 min，TZAP兔多克隆抗体(AB_2649779，上海赛默飞科技)(1 ∶100稀释)4 ℃冰箱过夜，PBS冲洗3次×3min，二抗(KIT-5220，福州迈新公司)37 ℃孵育30 min，DAB显色5 min。苏木精复染，二甲苯透明，中性树脂封固。

1.3 结果判读TZAP表达于细胞质和细胞核内，呈黄色或棕黄色颗粒。按阳性细胞着色强度计分：不着色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；按阳性细胞百分比计分：<5%为0分，5%～25%为1分，26%～75%为2分，>75%为3分；两项得分结果相乘为最后得分：0分为阴性，其余为阳性。

1.4 统计学分析采用SPSS 19.0软件进行统计学分析，甲状腺乳头状癌和癌旁正常组织细胞核中TZAP的表达差异用Pearson χ2检验分析；TZAP核表达与甲状腺乳头状癌临床病理特征的相关性采用Spearman等级分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TZAP蛋白在甲状腺乳头状癌及癌旁正常组织中的表达TZAP蛋白在癌旁正常组织的细胞质和细胞核中均为阳性(71/71，100%)；与癌旁正常组织相比(图1)，TZAP在甲状腺乳头状癌组织的细胞核中表达下调(图2、3)，甲状腺乳头状癌中TZAP细胞质阳性率为100%(71/71)，细胞核阳性率为52.11%(37/71)，两者表达差异有显著性(χ2=42.113，P<0.001)。

图1 癌旁正常组织滤泡上皮中TZAP呈细胞质和细胞核阳性，EnVision法 图2 甲状腺乳头状癌组织中TZAP呈细胞质和细胞核阳性，EnVision法

图3 甲状腺乳头状癌组织中TZAP呈细胞质阳性，细胞核阴性，EnVision法

2.2 TZAP蛋白表达与甲状腺乳头状癌临床病理特征的相关性TZAP蛋白表达与肿瘤大小(rs=-0.249，P=0.036)、TNM分期(rs=0.264，P=0.026)呈负相关；与淋巴结转移(rs=-0.356，P=0.002)、甲状腺外播散(rs=-0.250，P=0.035)呈正相关；肿瘤直径≥1 cm、有甲状腺外播散、有淋巴结转移和TNM分期较高者TZAP阴性率较高(表1)。与患者年龄(P=0.421)、性别(P=0.892)、多灶性(P=0.206)及是否伴有桥本甲状腺炎(P=0.459)无相关性(表1)。

表1 甲状腺乳头状癌中TAZP蛋白表达与临床病理特征的关系[n (%)]

3 讨论

TZAP是端粒锌指结合蛋白，由ZBTB48基因编码，在染色体上定位于1p36。TAZP蛋白含有688个氨基酸，相对分子质量为7.7×104，在羧基端含有11个C2H2类型的锌指结构，氨基端高度保守，在其氨基末端保守区与锌指结构域之间存在呈酸性的反式激活区[8]。ZBTB48基因所在的染色体区域在多个人类恶性肿瘤中出现异常，包括重组(平滑肌瘤、白血病等)或删失(神经母细胞瘤、黑色素瘤、嗜铬细胞瘤、结肠癌、乳腺癌等)[5]，提示该基因可能是潜在的抑癌基因[9]。

TZAP可以直接结合到端粒的TTAGGG重复序列，可以触发“端粒修剪”，导致端粒重复片段的删除，使端粒长度变短[10]。端粒缩短能限制干细胞的复制能力[11]，调控细胞永生化和衰老之间的平衡，这些分子事件的调控异常都被认为是癌症相关的关键分子事件[12]。以上数据提示TZAP对端粒的调控可能参与肿瘤的发生。

此外，TZAP也能作为转录因子调控相关靶基因的转录。TAZP能结合CDKN2A近端启动子区域，激活其转录本ARF的表达，促进p14ARF蛋白的表达[6]。p14ARF能直接抑制细胞周期进展[13]，还能通过p53信号通路(ARF-MDM2-TP53-p21WAF/CDKN1A)诱导细胞周期阻滞和细胞凋亡的发生。因此，TZAP能通过对端粒、细胞增殖和凋亡等的调控发挥抑癌作用。

本实验采用免疫组化EnVision法检测发现，在甲状腺乳头状癌组织中，细胞核内TZAP表达下调，且其下调与进展期临床病理特征相关(包括肿瘤体积大、淋巴结转移、甲状腺外播散、临床进展期)；提示TZAP可能参与甲状腺乳头状癌的发生、发展，其具体的机制有待进一步分析。同时，发现细胞质内TZAP表达无明确下调，提示胞质内TZAP可能具有与核内TZAP不同的功能。Uniprot数据库发现TZAP蛋白除经典的7.7×104异构体外，还有4个潜在的小分子量的异构体，氨基酸长度128～310 aa(https://www.uniprot.org/uniprot/P10074#sequences)。不同的异构体可能存在不同的亚细胞定位和功能，提示核内定位的异构体具有抑瘤作用，而非胞质内异构体。不同剪切异构体在甲状腺乳头状癌中的表达及功能，有待于后续进一步分析。

总之，甲状腺乳头状癌细胞核内TZAP表达下调，可能参与其发生、发展。