基于卵母细胞线粒体探讨早发性卵巢功能不全发生机制

朱轶轩，董晓英

(首都医科大学 1.基础医学院，2.中医药学院，北京 100069)

卵巢功能减退是导致女性生活质量下降的重要因素之一，其发病机制复杂且缺乏有效临床治疗手段，是医学界持续探索的重点领域之一。近年来，随着有关领域研究的开展，国内外学者对卵巢功能减退有了更加全面、客观的认识。早发性卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency，POI)是目前医学界公认的卵巢功能减退的重要阶段之一，2016年才被正式提出，并在不久之后取代了“原发性卵巢功能不全”，逐渐被接受应用。

根据《早发性卵巢功能不全临床诊疗中国专家共识》，早发性卵巢功能不全是指女性在40岁之前由于卵巢生理功能丧失引发的一系列异常表现的临床综合征[1]。其通常特征为低雌激素状态导致的月经稀发或闭经、潮热、盗汗、阴道干燥、性交痛、关节痛、泌尿系感染、焦虑、不孕症、认知功能异常等[2]，并伴有高水平FSH、LH和低水平E2[3]。POI的诊断标准：(1)染色体正常，以往有过正常月经；(2)小于40岁；(3)月经稀发或停经至少4个月以上；(4)4～6周内，至少2次血清基础FSH>25 U/L[4]。约1%的40岁以下女性患有POI，对于POI患者来说，生育率下降是最严重的问题之一，患者自然妊娠的几率非常小，通常在4%～5%之间，对于当代医学来说，POI的治疗是一个重大挑战[5]。

卵母细胞发育异常是POI的重要发病原因之一，其发育过程与卵母细胞线粒体有着密切联系。本文旨在通过探讨卵母细胞线粒体与POI的联系，为POI的治疗提供新思路。

一、卵母细胞线粒体功能及损伤机制概述

1.卵母细胞线粒体的结构和功能：线粒体是生物细胞内一短棒状细胞器，由外向内依次有线粒体外膜、线粒体外室、线粒体内膜、线粒体内室等结构。线粒体内室中一般含有基质颗粒、线粒体脱氧核糖核酸(Mitochondrial Deoxyribonucleic Acid，mtDNA)、线粒体核糖核酸(Mitochondrial Ribonucleic Acid，mtRNA)和其他参与呼吸链的各元件。卵母细胞线粒体是卵母细胞进行氧化代谢的场所，负责卵母细胞有氧呼吸，产生ATP，为卵母细胞的成熟和受精提供能量，对卵母细胞的正常发育增殖具有重要意义，同时，卵母细胞线粒体DNA与呼吸链存在一定联系，其突变可能会使卵母细胞代谢功能受损而死亡。因此，卵母细胞线粒体结构和功能异常可能是许多卵巢相关疾病的重要发病原因(图1)。

图1 线粒体的生理特征示意图

2.卵母细胞线粒体损伤的原因：机体的新陈代谢通常会产生具有高度活性的氧自由基，正常情况下，氧自由基的产生和清除会在机体的调控下维持平衡以实现体内氧化系统和抗氧化系统的相对稳定，而在病理情况下，机体生成过量的氧自由基使得抗氧化防御系统受损，氧自由基产生和清除的动态平衡遭到破坏，机体就会处于氧化应激状态[6]。由于线粒体中，电子传递链将电子从代谢物转移到氧气中，并将提取的能量作为膜电位储存起来，作为生成ATP或热量所需的膜电位。氧化应激状态下，生物膜易被氧自由基破坏从而改变膜的结构和活性，引起线粒体膜渗漏和通透性增加[7]。这些变化带来的膜电位下降会使线粒体肿胀、线粒体嵴破坏或消失、基质不可见[8]。同时，氧自由基还能直接攻击DNA等生物大分子，作用于DNA时，会导致DNA链断裂，增加DNA的基因组不稳定性，改变细胞的基因表达[9]。卵母细胞mtDNA是典型的易受攻击生物大分子，它缺少保护机制且修复系统受限，其中的嘌呤和嘧啶对氧自由基非常敏感，极易受到氧自由基侵袭而使DNA链断裂，引起相关卵母细胞mtDNA基因控制的功能异常或缺失[10]。

二、卵母细胞线粒体与POI

1.线粒体异常通过影响颗粒细胞正常功能导致的POI：卵母细胞线粒体通过代谢为颗粒细胞提供能量，以维持其正常功能。颗粒细胞与卵母细胞之间存在着大量缝隙连接，并通过缝隙连接输送营养物质和信号分子进入卵母细胞，如氨基酸、核苷酸等，以促进卵母细胞胞核与胞质成熟。因此，卵母细胞线粒体可以通过颗粒细胞调控相应的卵母细胞生理功能。当机体处于氧化应激状态时，线粒体膜通透性增加，过多Ca2+流入线粒体内降低跨膜电位，同时活性氧簇(Reactive Oxygen Species，ROS)激增，二者共同作用诱导颗粒细胞凋亡[11]。随着女性年龄增长，线粒体的老化会也会使线粒体自身的数量和内部结构发生不利改变，活性和功能降低，对颗粒细胞的供能减少[12]，还会导致线粒体产生的抗氧化酶或非酶性抗氧化物，如超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)、过氧化氢酶等减少，过剩氧自由基不能得到及时清除，机体的氧化系统处于优势地位，颗粒细胞更容易受到ROS攻击[13-14]。颗粒细胞中的细胞死亡配体和细胞死亡受体系统是卵泡颗粒细胞的关键存活因子或凋亡因子，充当着卵泡发育或闭锁的诱导物[15]。当颗粒细胞凋亡时，卵母细胞会失去进行生理活动所需的信号和能量而停止发育，发生闭锁，引起卵巢储备功能下降(decreased ovarian reserve，DOR)。临床资料表明，部分卵巢储备功能问题的积累会进一步损伤卵巢的其他功能，引起POI[16]。

2.mtDNA异常引起的 POI：mtDNA是位于线粒体基质的双链环状DNA，其所有基因都位于该单一环状DNA分子上。人体的mtDNA在ATP合成过程中不受组蛋白的保护几乎裸露于线粒体基质中[17]，这使得它成为容易发生基因重组突变的部位。对于真核生物而言，线粒体基因组不同于核基因组，因为亲代精子的mtDNA在受精的过程中不可以进入卵母细胞，子代mtDNA 全部来自于母系，不发生再结合，所以mtDNA的遗传过程属于母系遗传[18]，因此，人体只能通过卵母细胞传递mtDNA携带的遗传信息。卵母细胞mtDNA的拷贝数决定了细胞内线粒体的数量[19]，同时mtDNA又控制着呼吸链和氧化磷酸化体系[20]，可以说是卵母细胞线粒体的“中枢”。

实验证明，随着女性年龄的增长，卵母细胞内的mtDNA拷贝数会明显减少，引起线粒体数量的下降、卵母细胞凋亡以及胚胎发育阻滞[21]。由于卵母细胞mtDNA呈低氧化磷酸化代谢状态且缺少组蛋白的保护，相较于其他细胞的mtDNA更容易受到ROS攻击[22-23]，尤其是在氧化应激状态下，mtDNA发生缺失或突变的概率会大大增加[24]。mtDNA具有很多突变形式，最常见的是ΔmtDNA4977片段缺失，该片段控制着ATPase6、ATPase8、NADH脱氢酶亚基3(NADH dehydrogenase subunit 3，ND3)、ND4L、ND4、ND5等线粒体基因核苷酸，一经突变，通常会损伤mtDNA编码的氧化磷酸化相关蛋白的合成[25-26]。

卵母细胞mtDNA拷贝数减少将引起线粒体数量下降甚至卵母细胞凋亡，这都会使线粒体功能减退进而导致卵母细胞因供能不足，无法正常完成生理活动[21]。mtDNA的重组突变可能会降低线粒体蛋白质的翻译水平，使呼吸链产生一定的缺陷，阻碍线粒体发挥其正常功能[27]，同样会影响卵母细胞的正常发育。若mtDNA的不利改变超出机体调节范围，会加速卵母细胞衰老，降低卵母细胞质量，为POI埋下隐患(图2)。

图2 ROS攻击mtDNA对细胞功能影响的示意图

3.线粒体分裂和融合功能异常引发的POI：线粒体是一种高度动态的细胞器，它的正常工作需要分裂和融合来调节自身动态以完成线粒体内物质的交换，当线粒体结构出现异常，引发线粒体功能缺陷时，受损线粒体可与正常线粒体通过融合分裂作用互换内容，从而改善线粒体结构缺陷并恢复其正常功能[28]。因此，线粒体的分裂和融合功能是“重塑”线粒体的重要手段。

线粒体融合基因2(Mitofusin，Mfn2)是分布于线粒体外膜的融合蛋白之一，具有高度保守的线粒体跨膜GTP酶(guanosine triphosphate ase，GTPase)功能[29]。该基因控制着线粒体的融合功能。同时，细胞中还存在一种dynamin样的GTPase分子(Dynamin 1 like，DNM1L)，该分子介导着线粒体的分裂[30]。这两者对线粒体维持分裂和融合动态平衡有着重要意义。在卵母细胞中，正常水平的Mfn2表达能通过融合作用使卵母细胞线粒体的结构和功能维持正常，而DNM1L则能够防止线粒体骤增聚团，二者共同作用保证了卵母细胞能够顺利进行代谢，防止卵巢功能受损[23]。

有研究发现，Mfn2蛋白和DNM1L表达量异常的小鼠，其卵巢组织内的ATP含量较低，而卵巢组织内ATP含量的降低通常伴随着线粒体结构功能的变化[29]。实验证明，Mfn2蛋白和DNM1L表达量异常的小鼠会因为卵母细胞线粒体融合与分裂失衡而导致线粒体结构出现异常，线粒体膜电势下降，ATP合成减少，卵母细胞纺锤体的组装和极体排放受阻，卵母细胞出现异常染色体排列和非整倍体，从而引发卵巢功能下降[24]。这种卵母细胞线粒体融合与分裂失衡容易在女性身上积累对卵母细胞的不利影响，引发POI。

三、基于改善卵母细胞线粒体的POI治疗方法

卵母细胞线粒体结构和功能改变导致的卵母细胞代谢受损是引起POI的重要原因之一，因此，改善卵母细胞线粒体质量也是治疗POI的有效手段之一。目前临床上基于卵母细胞线粒体可用的POI治疗方法包括胞浆移植、异体体细胞线粒体移植以及自体体细胞线粒体移植等[31]。

1.胞浆移植：是指将受精卵的细胞核转移到另一女性的健康去核卵母细胞中进行细胞重组的一种治疗方法，卵胞浆内单精子注射-胚胎移植(ICSI-ET)是临床上一种治疗不孕的胞浆移植相关方法[2]。但是胞浆移植缺乏动物模型的验证，移植成分复杂，不确定性较大，有关影响胞浆移植的因素如子线粒体功能、凋亡机制、遗传、母体转录物的存活、蛋白质和离子等方面的研究报道较少[32]，难以付诸临床应用。

2.异体体细胞线粒体移植：是指将不孕女性的线粒体更换为其他健康女性的线粒体的一种治疗方法[33]，Cohen等[34]用显微注射的方法将年轻妇女卵子5%～10%的细胞质注入体外受精反复失败患者和生育年龄较大患者的卵子内，结果发现胚胎质量明显改善，并有健康的胎儿出生。但是，因为这种治疗方法的伦理争议较大，实验基数小，其安全性和可行性仍有待确定。

3.自体体细胞线粒体移植：是用自身其他组织内健康细胞线粒体更换卵母细胞线粒体的一种治疗方案[35-37]。目前临床上已证实自体卵丘颗粒细胞线粒体移植技术能显著改善卵母细胞质量[38]。最近，梁晓燕教授团队也在世界上首次利用“卵母细胞内注射自体骨髓细胞线粒体”技术为一患者改善了胚胎质量[39]，为自体体细胞线粒体移植治疗方法提供了新思路。此外，还有培养卵原干细胞以获得线粒体来源等新兴技术[40]。

四、展望

线粒体是人体最重要的细胞器之一，越来越多的医学研究发现线粒体与许多难以治疗的疾病有着密切联系。在卵巢内，卵母细胞数量、结构和功能的变化可以通过供能、氧化应激和凋亡等途径影响卵巢功能引发POI。迄今为止，基于卵母细胞线粒体探讨POI发病机制的研究尚处于起步阶段，相关实验无论是种类、规模还是精确性都还不足以完全支撑已有的POI发病机制理论，且临床上的相关治疗方案还没有成熟。在未来的研究中，除了完善已有实验，提高已有实验的可信度和说服力外，还可以试着从卵母细胞线粒体区别于其他细胞线粒体的独特性入手，通过更多方面的实验探索针对线粒体异常引发的卵巢相关疾病的个性治疗方案。或者可以研究对卵母细胞线粒体更精准的物理操作方案，填补POI治疗领域的相关空白。