3种取材法检测尖锐湿疣皮损中人乳头瘤病毒及亚型分布的对比研究

胡雯，康晓静

尖锐湿疣（condyloma acuminatum，CA）临床表现为局部皮肤或黏膜出现良性疣状增生及赘生性皮损，由人乳头瘤病毒（human papilloma virus，HPV）感染的一种性传播疾病[1-3]。尖锐湿疣生长迅速，具有高复发性及传染性[4,5]，还存在不易察觉的亚临床感染状态，较难治愈，不仅给患者及其家属带来精神上和经济上的沉重负担，而且严重影响患者的身体健康。不同的HPV 型别在一定程度上决定了其感染部位、组织病理特征、临床表现及相应病程[6-8]。本文对新疆维吾尔自治区人民医院皮肤性病科就诊的尖锐湿疣患者采用实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测HPV 感染，并对比研究了3种取材方法的检出率，有助于了解相关HPV 病毒亚型在尖锐湿疣患者中的分布，对尖锐湿疣患者的准确诊断、治疗效果、预防等具有重要的临床意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 资料来源收集新疆乌鲁木齐地区2016年12月—2018年6月在新疆维吾尔自治区人民医院皮肤性病科门诊就诊的277例尖锐湿疣患者上皮细胞和组织标本。277例患者中男207例，女70例，汉族患者228例，维族患者49例，年龄19～81岁，平均年龄34.53岁，其中＜20岁20例，20～29岁112例，30～39岁53 例，40～49岁55 例，50～59岁26 例，＞60岁11例，并对277例患者标本进行了HPV 分型检测。

1.1.2 仪器与试剂HPV 基因分型检测试剂盒(潮州凯普生物化学有限公司)，可同时检测23 种基因型，包括16 种高危型（HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68、73、82）和7 种低危型（HPV6、11、42、43、44、53、81）。实时荧光定量PCR 扩增仪Rotor-Gen 5 Plex+HRM（南京爱楷能生物科技有限公司），生物安全柜BHC-1300IIA2[阿尔泰实验室设备（北京）有限公司]。

1.2 方法

1.2.1 标本采集 ①刮取法：刮取女性宫颈上皮细胞（男性生殖道分泌物），用无菌棉拭子在女性宫颈（男性尿道口内）取分泌物置无菌管中送检；②疣体涂擦法：用一次性注射器将疣体刺破后，再用棉拭子反复擦拭病灶处以获得足量的脱落细胞；③疣体微创采集法：将确认的疣体表面擦洗干净，应用眼科活检镊从疣体组织中取体积1.0 mm×1.0 mm×1.0 mm 组织标本，置1.0 ml无菌生理盐水中送检。

1.2.2 HP NA提取按HPV分型检测试剂盒说明书步骤操作提取DNA模板。其中，凯普一步法核酸提取试剂盒提取宫颈和尿道口以及疣体表面脱落细胞标本DNA；凯普三步法核酸提取试剂盒提取组织标本DNA。

1.2.3 实时荧光定量PCR检测本研究基于多重荧光PCR技术，通过实时荧光PCR仪，进行同步核酸扩增与检测。分成6个反应管，通过仪器4种荧光检测通道，从而对23种HPV基因型进行分型检测，及对细胞内对照β-globi NA检测。细胞内对照DNA用于评估样本质量及PCR抑制因素。

1.2.4 结果判断检测结果判断严格按照试剂盒说明书。样本的Ct值显示为Undet，判断为阴性；样本的Ct值≤40，判断为阳性；若为40＜Ct值＜45的样本建议重做，重做结果Ct值＜40者为阳性，否则为阴性。

1.3 统计学方法

采用SPSS17.0统计软件进行统计学分析，计数资料以例数或百分率表示，组间比较采用χ2检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 HPV感染情况及基因型分布

277例标本中HPV 检测阳性者219例，阳性率为79.06%。阳性率居前4位的HPV 亚型分别为HPV6型（90/219）、11型（12/219）、16型（12/219）、42型（3/219），维汉以及男女患者之间HPV 阳性检出率相比差异均无统计学意义。HPV 感染主要是单一感染，多重感染则主要见于二重感染，其中，男、女患者二重感染差异有统计学意义（χ2=6.675，P＜0.05），见表1。

表1 HPV阳性尖锐湿疣患者亚型分布

2.2 各年龄段HPV 感染情况

检出的219例阳性标本中，单一感染阳性率高于多重感染阳性率，差异有统计学意义（P＜0.05）。单一HPV 感染者为140例（50.54%），多重HPV 感染者79例（28.52%）。20～29岁组阳性率最高，为86.23%，其次30～39岁和40～49岁的阳性率分别为83.01%和76.36%，见表2。

表2各年龄段HPV感染分布情况[n(%)]

2.3 3种不同方法取材检测结果

用刮取分泌物法、疣体涂擦法和微创取疣体新鲜组织3种方法对HPV 检出率分别为75.78%、76.15%和92.86%，其中刮取法与涂擦法HPV 检出率相比差异无统计学意义（χ2=1.327，P＞0.05），刮取法和涂擦法与微创法对HPV 检出率相比差异均有统计学意义（χ2=7.004，P＜0.05；χ2=5.456，P＜0.05），见表3。

表3 3种方法取材检测HPV-DNA的结果比较

3 讨论

尖锐湿疣临床表现为局部皮肤或黏膜出现良性疣状增生及赘生性皮损，其潜伏期通常平均3个月左右，短者3周，长者＞6个月。本病流行于全世界，是目前欧美及非洲国家最常见的性传播疾病（STD）之一[6]。尖锐湿疣在我国的发病率较高，近年迅速增加，给患者及其家属带来精神上和经济上的沉重负担[7]，具有严重的社会危害性，成为仅次于淋病的第二大性传播疾病[8]。尖锐湿疣与HPV 感染有关，目前已知的HPV 类型有200多种，其中有40余种亚型可经性接触感染泌尿生殖道，导致尖锐湿疣等皮肤病变。

在本研究中所采用的实时荧光定量PCR 检测HP NA 可以鉴定感染的HPV 具体型别以及多型别的混合感染，该检测方法特异性强、灵敏度高，且不受样本纯度、样本是否存活及样本类型等方面的影响，从而解决不易培养微生物的鉴定问题。本研究中277例标本中HPV 检出率为79.06%，感染型别以低危型6/11型为主要型别，与陈冬莲[8]及肖子娥和黄捷[9]的报告一致。感染以低危型别单一感染为主，多重感染则主要见于二重感染，维汉以及男女患者之间HPV 阳性检出率差异均无统计学意义，说明民族和性别的差异并不会影响其检出率。HPV 检测结果各年龄段之间的阳性率以20～29岁组阳性率最高，其次为30～39岁、40～49岁年龄段，可能与性行为习惯及免疫系统等因素有关。用刮取分泌物、疣体涂擦法和微创取疣体新鲜组织法进行取样，微创法与刮取法和涂擦法相比，微创法对HPV 检出率最高，差异有统计学意义，与李荣敏等[10]结果一致，说明微创法可作为诊断尖锐湿疣的首选方法。但毛雨等[11]对尖锐湿疣患者用棉拭子摩擦疣体表面进行HP CR 分型检测，结果表明其与微创法相比差异无统计学意义，并具有高敏感性，同时无明显创伤性，可代替既往的切除或钳取疣体。研究结果不同可能原因是无论直接取疣体组织，还是疣体表面脱落细胞，均有部分患者出现假阴性反应，一方面可能是未能提取到足够的HP NA 模板，另一方面可能是该实验检测的23型以外HPV 感染所致以及存在个体差异因素。在今后的研究中，应进一步加大样本量，对尖锐湿疣同一患者采用不同的取材方法将HPV 阳性率进行比较研究，这对于不同的患者人群，针对自身情况选择最优的取材方法，可更大程度的提高诊断的准确性具有一定的临床意义。