碎米桠小孢子发生与雄配子体发育

(河南中医药大学药学院，郑州 450046)

碎米桠(Rabdosiarubescens(Hemsl.) Hara)为唇形科香茶菜属的小灌木，主要分布于黄河、长江流域，主产于河南济源太行山一带。夏、秋二季茎叶茂盛时采割其地上部分，晒干，即为中药冬凌草。冬凌草具有清热解毒，活血止痛之功效[1]。现代研究证明，冬凌草还有抗肿瘤作用，作为天然药物在临床上的应用非常广泛。随着各地对碎米桠需求量的增加，野生的碎米桠资源由于乱采滥挖，导致自然资源枯竭。

目前，对碎米桠的研究更多地集中在化学成分及药理作用方面，但关于其有性生殖过程尚未见详细报道，小孢子发生和雄配子体发育是植物有性生殖过程的重要方面。花药是被子植物的雄性器官，是花粉发生和发育的场所，其结构及功能的正常行使直接影响花粉的发育与成熟过程，花粉发育包括小孢子发生和雄配子体发生2个连续过程。因此，通过组织解剖学手段观察了碎米桠花药和花粉发育过程，旨在揭示小孢子发生和雄配子体发育的主要特征，为探究碎米桠的胚胎学特征奠定基础，也为进一步开展碎米桠繁殖育种研究做好准备。

1 材料与方法

研究材料采自河南省济源市。碎米桠的花期为每年8—10月份，在开花初期，采摘不同大小的花蕾，同时收集绽开花的花药，放入FAA固定液中进行固定，并于4 ℃冰箱中保存备用。

1.1 石蜡切片

FAA固定48 h，然后酒精梯度脱水(50%、70%、85%、95%、100%)，二甲苯透明后用石蜡包埋，使用LEICA-RM 2016轮转式切片机切片，切片厚度7～12μm，用铁钒-苏木精染色， 用奥林巴斯BX 51显微镜观察并照相。

1.2 半薄切片

分别取不同发育时期的花蕾或花药用FAA固定液固定后，50%、70%、80%、90%、95%、95%乙醇∶95%丙酮(1∶1)、95 %丙酮和100%丙酮逐级梯度脱水，每步骤10 min，脱水后，用Epon 812树脂包埋。用莱卡R型超薄切片机制作0.5～1μm厚的半薄切片。染色采用高碘酸-希夫试剂。用奥林巴斯BX 51显微镜观察并照相。

2 结 果

2.1 解剖特征

碎米桠的花期一般为8—10月，花为两性花，每朵花内有雄蕊4枚。成熟的花药由4个花粉囊构成。

2.2 花药壁的发育

年幼的花药外有1层表皮，表皮内充满一团薄壁组织细胞(图版： 1)。稍后，在横切片上观察到花药在4个角隅表皮层下面有一群细胞质浓厚、细胞核显著的大型细胞，这就是孢原细胞(图版，2)。孢原细胞经过一次切向分裂，形成产生内外2层细胞，分别为初生造孢细胞和初生壁细胞(图版：3)。初生壁细胞经切向分裂形成2层细胞(图版：4)，外层细胞再分裂1次形成药室内壁和中层，内层细胞为绒毡层。随着花药的生长，花药的体积增大，此时在花药的横切片上观察时，可以看到花药在4个角隅形成囊状体构造，这就是花粉囊，碎米桠花药有4个花粉囊，位于花药的两侧，一边1对。花药壁由4层细胞构成，由外至内分别为表皮、药室内壁、中层和绒毡层(图版：5，6)。 药室内壁细胞通常只围绕在花粉囊的外侧，绒毡层细胞则完整地围绕着花粉囊(图版：5，6)，向着药隔一侧的绒毡层细胞是由小孢子母细胞邻近的药隔薄壁组织细胞分化形成的。

表皮细胞在花药发育过程中在花药壁中占据的厚度比较小(图版：6～13)，在花药发育接近成熟时被撑扁，最终破坏(图版：14)或变为乳突状，花粉成熟时，仅留下少许残迹，花药接近成熟时表皮细胞最后批次分离呈乳突状(图版：15)，当花药成熟时仅留下干枯的残迹(图版：16)。药室内壁在花药发育的后期径向伸长，排列整齐(图版：13，14)，在花药发育的晚期，药室内壁的径向壁和内切向壁上具有许多径向排列纤维状的次生加厚的条纹(图版：15)，这时的药室内壁也称纤维层，加厚条纹一般是积累了纤维素，花药成熟时略微木质化。药室外壁细胞壁上的加厚条纹发育较晚，在花粉将要散播之前才发育完全，此时药室内壁之内的药室内充满了花粉(图版：16)。 在花粉发育过程中，中层细胞由于不断受到表皮细胞和绒毡层细胞的挤压呈扁平状(图版：8～10)，细胞核小，细胞质稀少，在四分体解体进入游离小孢子时期后，中层细胞逐渐解体(图版：11～13)，至小孢子单核靠边期时被完全吸收(图版：14)。在花药发育的早期，绒毡层细胞是单核的，细胞近方形，细胞核大，细胞质浓厚(图版：5)。在小孢子母细胞减数分裂的早期，绒毡层细胞逐渐增大变长，细胞核进行分裂，此时，绒毡层细胞以双核形态存在(图版：6)，细胞质变浓(图版：7，8)，在四分体时期绒毡层细胞体积最大，液泡体积达到最大，细胞质颜色较浅，此时绒毡层的位置不变，细胞保持完整性(图版：9，10)。在四分体即将解体时，绒毡层内切向壁和径向壁已经出现退化现象(图版：11)，在四分体以后，绒毡层的内切向壁和径向壁解体(图版：12，13)，在小孢子发育到单核靠边期时，绒毡层细胞几乎完全解体(图版：14)，在花粉发育成熟时，花药壁只剩下纤维层和表皮细胞的残迹(图版：15，16)。

2.3 小孢子的发生

当花药壁形成时，初生造孢细胞进行有丝分裂以后，产生很多小孢子母细胞。小孢子母细胞排列紧密，细胞壁薄， 细胞核显著，细胞质浓厚， 其横切面呈多边形(图版：5)。小孢子母细胞发育到一定阶段，在其质膜与细胞壁之间沉积一定厚度的胼胝质(图版：6)，原来的细胞壁解体，细胞质变浓、细胞核增大，核仁明显(图版：7)。小孢子母细胞经过发育，进入减数分裂状态，小孢子母细胞由原来的紧密排列(图版：7)变为疏松排列，形状也由原来不规则的多边形变为近圆形，细胞质浓厚，细胞核大(图版：8)。小孢子母细胞减数分裂第1次分裂完成后不形成细胞壁，直接进入到减数分裂第2次分裂形成4个小孢子(图版：9)，小孢子又叫花粉细胞。4个小孢子排列成四面体形，被共同的胝胝质壁包围，相互之间也被胼胝质壁分离(图版：10)。随着花药的发育，四分体发育到后期，胼胝质逐渐解体(图版：11)，4个小孢子相互分离开来，发育成为游离小孢子，刚释放的小孢子体积较小，形状不规则(图版：12)。

注：EP为表皮层；EN为药室内壁；M为中层；T为绒毡层；GC为生殖细胞；VC为营养细胞。1为花药原基；2为孢原细胞；3为孢原细胞分裂；4为初生壁细胞分裂；5为花药壁分化完成，初生造孢细胞经过分裂，形成小孢子母细胞；6、7为小孢子母细胞时期；8为小孢子母细胞减数分裂时期，中层细胞开始解体；9、10为四分体时期的花药壁，4个小孢子被共同的与各自产生的胼胝质壁包被着；11为四分体的胼胝质壁解体；12为刚从四分体中释放出来变形的小孢子，多边形或圆形；13为游离小孢子形成中央大液泡；14为小孢子单核靠边期的花药壁；15为花药壁只剩下表皮层细胞和纤维层细胞；16为成熟的花药；17为单核中央期小孢子；18为单核靠边期小孢子,大液泡将细胞核挤向细胞壁一侧；19为小孢子进行有丝分裂，形成营养细胞和生殖细胞；20为2-细胞花粉粒。图版 碎米桠小孢子发生和雄配子体形成

2.4 雄配子体的发育

小孢子是雄配子体的第一个细胞，小孢子经过进一步发育后，体积稍变大，无明显的液泡，核位于细胞中央，具浓厚的细胞质，细胞壁不明显，此时期为小孢子单核中央期(图版：17)。之后，小孢子体积迅速增大，形成一个中央大液泡，细胞呈圆形，典型的花粉壁和6个萌发沟开始形成(图版：13)。中央大液泡将细胞核挤向细胞壁一侧，进入单核靠边期(图版：14，18)。后来，小孢子继续发育，靠近细胞壁的细胞核进行一次不均等的有丝分裂，形成大小显著不同的2个细胞，较大的为营养细胞，位于花粉中央，较小的为生殖细胞(图版：19)，生殖细胞紧贴花粉壁一侧，并靠着营养细胞的壁。不久，生殖细胞转移到营养细胞之内，花粉粒体积继续增大，形成成熟的二细胞型花粉粒(图版：16，20)。花粉粒发育成熟后，花粉囊开裂，最后花药壁仅留存药室内壁和残存的表皮(图版：16)，以二核形态进行传粉(图版：20)。

3 讨 论

对碎米桠小孢子发生与雄配子发育过程的观察表明，碎米桠雄蕊花药具有4个花粉囊，花药壁由四部分构成，由外到内依次是表皮、药室内壁、中层(一层)和绒毡层。根据Davis的分类方法，碎米桠花药壁发育类型属双子叶型[2]。碎米桠成熟的花药最外层是一层破坏了的表皮细胞层，表皮层之内是一层径向伸长的大型细胞，即药室内壁，花药内壁细胞纤维状加厚，有利于成熟花药的开裂。花药壁中层只有一层细胞，从花药发育的早期开始，中层细胞被挤压，其细胞内含物被相邻的绒毡层和药室内壁吸收。

绒毡层在花粉发育过程中起重要作用[3-6]，为花粉发育提供营养物质，因而与花粉发育密切相关[7]。绒毡层有2种类型[8,9]：一种叫变形绒毡层，变形绒毡层在早期就发生解体，原生质体移动到花粉囊中并融合为一体；另一种叫分泌绒毡层或腺质绒毡层，分泌绒毡层向花粉囊肿分泌小孢子发育需要的各种营养物质，在花粉发育的过程中细胞始终保持其完整性，细胞位置不变，直到花粉发育成熟之后才破坏消失。由于植物种类不同，花药壁的细胞层数以及绒毡层的发育方式往往有所变化[10]。双子叶植物中大多数都具有分泌绒毡层，碎米桠花药的绒毡层在退化过程中，细胞壁消失，营养物质可以通过其保留下来的细胞膜释放到花粉囊内，花粉成熟后绒毡层完全自溶，因此属于分泌绒毡层。

花粉发育过程包括小孢子发生和雄配子体形成两个方面[11,12]，小孢子母细胞减数分裂形成4个小孢子是小孢子发生的过程[5]，小孢子也叫花粉细胞。双子叶植物花粉母细胞的减数分裂过程只进行一次胞质分裂，叫做同时型胞质分裂，减数分裂所形成的4个小孢子(四分体)排列成四面体形。碎米桠小孢子母细胞也是进行同时型胞质分裂，减数分裂产生的4个小孢子排列为四面体形。四分体中的4个小孢子除了共同被小孢子母细胞原来的胝胝质壁所包被外，小孢子各自产生自己的胝胝质壁，胝胝质是一种多糖类化合物，大多数化合物的分子是不能够透过胝胝质的，因此，胝胝质壁的出现使得小孢子母细胞之间及4个小孢子彼此之间相互隔离开来，这种隔离对于花粉母细胞减数分裂产生小孢子是非常必要的，否则将产生不育的花粉[13,14]。在绒毡层细胞产生的胼胝质酶的作用下，发育到后期时的四分体的胝胝质壁逐渐解体，绒毡层细胞也开始产生孢粉素，4个小孢子相互分离开来。

雄配子体形成是从小孢子开始至精子产生的过程，小孢子是雄配子体的第1个细胞，小孢子经历2次有丝分裂[15,16]，四分体的4个小孢子相互分离后，细胞增大体积，先进行1次不均等的有丝分裂，产生1个营养细胞(较大)和1个生殖细胞(较小)；生殖细胞被1层胼胝质构成的薄壁包被着，紧靠营养细胞的壁。生殖细胞的胼胝质壁存在时间不长，不久就消失，此时，生殖细胞转移到营养细胞之内，包埋在营养细胞的细胞质中；第2次是生殖细胞分裂，产生2个精子。多数植物的小孢子只进行1次有丝分裂形成2个细胞(营养细胞和生殖细胞，为二细胞花粉)，花粉粒就发育成熟了，第2次分裂要在花粉管中进行。但是也有很多植物的生殖细胞在花粉内再进行1次有丝分裂，形成2个精子，在花粉散布时含有3个细胞(三细胞花粉)。在已经研究过的植物中大约有75%的植物就有二细胞花粉，有25%的植物具有三细胞花粉[17]。碎米桠雄配子体在开花时只完成1次有丝分裂，产生1大1小2个细胞，较大的为营养细胞，较小为生殖细胞，后来，生殖细胞转移到营养细胞之内，成熟的花粉粒为二细胞型。第2次分裂要在花粉管中进行。花粉成熟后，花药每一侧的2个花粉囊打通，各形成一室，即为药室，此时花药也发育成熟了。

碎米桠小孢子发生和雄配子体发育特征与Harley et al[18]对唇形科总结的特征大体上一致，然而，在有些特征方面有也所不同。例如：Harley et al认为唇形科的绒毡层具有多细胞核，而已经报道的几种唇形科植物如：黄芩[19]、石香薷[20]、线纹香茶菜[21]、地椒[22]等绒毡层也都含有2个细胞核，本研究发现碎米桠的绒毡层也是含有2个细胞核；此外，与碎米桠的花粉粒为6个萌发沟2-细胞型，这与Harley et al[18]总结的也不一致。