云南松松塔抗肿瘤活性部位的多糖含量测定*
2020-04-18李冬梅陈晓萍李春艳刘光明
李冬梅,陈晓萍,李春艳,刘光明
（大理大学药学与化学学院，云南 大理 671000）
云南松(Pinus yunnanensisFaranch）为松科松属植物,又名青松、飞松、长毛松,分布于我国西南地区,主要分布于云南、西藏东南部、贵州、广西等地。松塔系松科松属植物的球果,又名松球、松果[1-2]。云南松松塔中含有萜类、黄酮、多糖、酚酸类、木脂素类等多种化学成分[3-6],其中多糖研究最为广泛,云南松松塔多糖由甘露糖(Man）,鼠李糖(Rham）,葡萄糖醛酸(Glc UA）,半乳糖醛酸(Gal UA）,葡萄糖(Glc）,半乳糖(Gal）, 木糖(Xyl）, 阿拉伯糖(Arab）和岩藻糖(Fuc）组成[7]。研究发现松塔具有良好的抗肿瘤活性,如日本白松松塔水提物可抑制移植于小鼠的腹水瘤及S180(实体瘤）细胞生长和降低小鼠乳汁中鼠乳房肿瘤病毒的含量[8-10]。课题组在前期研究中发现,云南松松塔提取物对多种肺癌细胞和肝癌细胞的增殖具有抑制作用[11-12]。本文考察了苯酚-硫酸法中不同显色条件对云南松松塔抗肿瘤活性部位多糖含量测定的影响,从而确定最佳显色条件,采用最佳显色条件测定了云南松松塔抗肿瘤活性部位的多糖含量[13],该方法操作简便、稳定性好,可用于云南松松塔抗肿瘤活性部位多糖含量的测定。
1 仪器与试剂
TU-1901双光束紫外可见分光光度计,北京普析通用仪器有限责任公司；FA2004N型分析天平,上海精密科学仪器有限公司；超声波清洗器,上海声源超声波仪器设备有限公司；HH-S2s数显恒温水浴锅；HG-9075A型电热恒温鼓风干燥机,上海一恒科学仪器有限公司。
云南松松塔抗肿瘤活性部位为课题组前期研究中,通过活性筛选从云南松(Pinus yunnanensisFaranch）松塔中得到的具有抗肿瘤活性的提取部位。葡萄糖对照品(批号:20151214,分析纯）,国药集团化学试剂有限公司；苯酚和浓硫酸均为分析纯；实验用水为蒸馏水。
2 方法与结果
2.1 溶液的配制
2.1.1 5%苯酚溶液的配制
精密量取5 mL重蒸的苯酚于100 mL棕色容量瓶中,加蒸馏水使其溶解,定容,摇匀,避光保存(临用前配制）。
2.1.2 葡萄糖标准溶液的配制
精密称取于105℃干燥至恒重的葡萄糖对照品0.0200 g于100 mL容量瓶中,加水定容,摇匀,得0.20 mg·mL-1的葡萄糖溶液。精密量取上述葡萄糖溶液1.0 mL于10 mL容量瓶中,加水定容,摇匀,即得0.02 mg·mL-1的葡萄糖标准溶液。
2.1.3 样品溶液的配制
精密称取于105℃干燥至恒重的云南松松塔抗肿瘤活性部位粗粉25.0 mg于25 mL的容量瓶中,加水溶解,定容并摇匀,即得样品溶液。精密量取样品溶液1.0 mL于10 mL容量瓶中,加水溶解,定容,摇匀,即得供试品溶液。
2.2 最大吸收波长的选择
精密量取上述葡萄糖标准溶液和供试品溶液各2.0 mL分别置于2支10 mL具塞试管中,分别加5%苯酚溶液1.0 mL,浓硫酸5.0 mL,加水定容,摇匀,室温放置10 min,置沸水浴中加热10 min,立即取出置冷水浴中冷却至室温,以2.0 mL的蒸馏水以同样方法作空白对照[13],TU-1901双光束紫外可见分光光度计400～600 nm范围内进行光谱扫描,确定最大吸收波长为491 nm。
2.3 最佳显色条件的选择
2.3.1 水浴温度的选择
精密量取2.0 mL的供试品溶液于10 mL具塞试管中,依次加入5%苯酚溶液1.0 mL,浓硫酸5.0 mL,加水定容,摇匀,于室温放置10 min,分别于40℃、50℃、60℃、70℃、80℃和沸水浴下加热10 min后,立即取出置冷水浴中冷却至室温,测定吸光度。结果见图1,结果表明,最佳水浴温度为60℃。
图1 水浴温度对吸光度的影响Fig.1 Effect of water bath temperature on absorption
2.3.2 水浴加热时间的选择
精密量取2.0 mL的供试品溶液于10 mL具塞试管中,按照2.3.1项下方法显色,60℃水浴温度下分别加热10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min,然后立即取出置冷水浴中冷却至室温,测定吸光度,结果见图2,结果表明,最佳水浴加热时间为20 min。
图2 水浴加热时间对吸光度的影响Fig.2 Effect of heating time in water bath on absorption
2.3.3 苯酚用量的选择
精密量取2.0 mL的供试品溶液于10 mL具塞试管中,分别加入0.3 mL、 0.4 mL、 0.5 mL、 0.6 mL、 0.7 mL、 0.8 mL、0.9 mL、1.0 mL 5%苯酚溶液,按照2.3.1项下方法显色,于60℃水浴中加热20 min,立即取出置冷水浴中冷却至室温,测定吸光度,结果见图3,结果表明,最佳的苯酚溶液用量为0.6 mL。
图3 苯酚用量对吸光值的影响Fig.3 Effect of the amount of phenol on absorption
2.3.4 浓硫酸用量的选择
精密量取4份2.0 mL的供试品溶液分别置于4支10 mL具塞试管中,分别加入5%苯酚溶液0.6 mL,向4支试管中分别加入4.0 mL、5.0 mL、6.0 mL、7.0 mL浓硫酸,按照2.3.1项下方法显色,测定吸光度,结果见图4,结果表明,最佳的浓硫酸用量为6.0 mL。
图4 浓硫酸用量对吸光度的影响Fig.4 Effect of theamount of concentrated sulfuric acid on absorption
根据实验结果,确定样品溶液的最佳显色条件为:水浴加热温度60℃,水浴加热时间为20 min,5%苯酚溶液的用量为0.6 mL,浓硫酸用量为6.0 mL。
2.4 方法学考察
2.4.1 标准曲线的绘制
精密称取25.2 mg干燥至恒重的葡萄糖对照品于25 mL容量瓶中,加水溶解,定容,摇匀,即得1.008 mg·mL-1的葡萄糖储备溶液。分别精密量取葡萄糖储备液0.00 mL、0.25 mL、0.75 mL、1.25 mL、1.75 mL、2.25 mL于25 mL容量瓶中,加水定容,摇匀,即得葡萄糖系列溶液。精密量取上述葡萄糖系列溶液各2.0 mL分别置于6支10 mL具塞试管中,依次加入0.6 mL 5%苯酚溶液、6.0 mL浓硫酸,加水定容,摇匀,室温放置10 min,然后在60℃水浴中加热20 min,立即取出置冷水浴中冷却至室温,测定吸光度。以吸光度值(A）为纵坐标,葡萄糖溶液的浓度(μg·mL-1）为横坐标,绘制标准曲线,计算回归方程。结果表明,葡萄糖溶液在2～18 μg·mL-1范围内其浓度与吸光度线性关系良好,回归方程为A=0.0423C+0.0042(r=0.9998）。
2.4.2 精密度试验
精密量取2.0 mL供试品溶液置于10 mL具塞试管中,按2.4.1项下方法显色,连续测定吸光度6次,RSD为0.025%,表明精密度良好。
2.4.3 稳定性试验
精密量取2.0 mL供试品溶液置于10 mL具塞试管中,按2.4.1项下方法显色,每隔20 min测定一次吸光度,考察样品溶液在2 h内显色的稳定性,结果表明供试品溶液在2 h内稳定,RSD为0.87%。
2.4.4 重复性实验
精密量取2.0 mL供试品溶液6份,分别置于6支10 mL具塞试管中,按2.4.1项下方法显色,测定吸光度,RSD为1.8%,表明该方法重现性良好。
2.4.5 加标回收率试验
精密称取干燥至恒重的葡萄糖对照品0.0205 g于100 mL容量瓶中,加水定容,摇匀,即得0.205 mg·mL-1的葡萄糖溶液。精密量取上述葡萄糖溶液 0.0 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL于6支10 mL容量瓶中,加水定容,摇匀, 即得 0.0 μg·mL-1、 20.5 μg·mL-1、 41.0 μg·mL-1、61.5 μg·mL-1、 82.0 μg·mL-1、 102.5 μg·mL-1的葡萄糖溶液。精密量取1.0 mL供试品溶液6份,分别置于6支10 mL具塞试管中,各加入上述葡萄糖系列溶液1.0 mL于上述6支具塞试管中,按2.4.1项下方法显色,计算回收率,平均加标回收率为98.0%,RSD为1.4%。
2.5 样品含量测定
精密称取3份干燥至恒重的云南松松塔抗肿瘤活性部位粗粉25.0 mg于25 mL容量瓶中,配制3份供试品溶液。精密量取上述供试品溶液各2.0 mL,按2.4.1项下方法显色,测定吸光度值,计算多糖含量,结果见表1,云南松松塔抗肿瘤活性部位的多糖平均含量为44.07%。
表1 云南松松塔抗肿瘤活性部位多糖含量测定（n=3）Table 1 Determination of thecontent of polysaccharide in the anti-tumor active site from pinecones of Pinus yunnanensis Faranch（n=3）
3 结 论
本文对云南松松塔抗肿瘤活性部位多糖含量测定的最佳显色条件进行了考察,通过实验确定最佳显色条件为:水浴加热温度为60℃,水浴加热时间为20 min,5%苯酚溶液的用量为0.6 mL,浓硫酸的用量为6.0 mL。该方法操作简便、精密度良好,且在2 h内稳定,可用于云南松松塔抗肿瘤活性部位多糖含量的测定,云南松松塔抗肿瘤活性部位的多糖含量为44.07%。
