微波辅助优化亚侧耳多糖提取工艺的研究*

张致呈,刘 燕,赵志刚,李贵文

（皖南医学院药学院，安徽 芜湖 241002）

亚侧耳,又叫做元蘑(产地黑龙江一带）、冬蘑、黄蘑,形似扁状半圆形和肾脏形,以黄绿色为主,有一定粘度。亚侧耳主要生长在腐烂的阔叶树中,分布在北方、川藏地区,是一种木腐朽菌,可以食用[1]。中医学理论认为,亚侧耳性甘、温和,可以祛火清热,排除湿气,在治疗肝硬化、癫痫等方面有显著效果,同时还能够减轻肌肉疼痛,消除眼睛红肿、胀痛等病症[2]。多糖是亚侧耳的主要成分,也是有药用价值的部分,亚侧耳多糖一方面可以直接杀伤肿瘤细胞,另一方面还可以免疫调节人体。亚侧耳多糖能够降低辐射所致的免疫功能损伤影响,而且还能增强机体的防御能力,同时还能降低和修复化疗药物对机体免疫系统的破坏,起到增效减毒的作用,它体现了中医的精髓[3-4]。目前,关于亚侧耳的研究多集中于药理方面,而在提取工艺方面的研究较少,本次试验首次采用正交设计对微波辅助提取亚侧耳多糖的工艺条件进行优化,为亚侧耳活性多糖的工业化生产提供一定的依据。

1 实 验

1.1 仪器与试剂

RE5298标准旋转蒸发仪,上海亚荣生化仪器厂；MD6A微波样品处理系统,北京盈安美诚科学仪器有限公司；UV-5100紫外可见分光光度计,上海元析第三分析仪器厂；AB104-N电子分析天平,梅特勒-托利多仪器有限公司。

亚侧耳(购于毫州药材市场）；95%乙醇、葡萄糖、浓硫酸、氯仿、正丁醇、苯酚、无水乙醇等均为分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1 多糖含量的检测

用葡萄糖作为标准品,采用硫酸—苯酚法进行检测[5]。

1.2.2 标准曲线绘制

取六只50 mL容量瓶,将已经烘干过的葡萄糖作为标准品配置所需要的标准液。分别取 0 mL、3 mL、6 mL、9 mL、12 mL、15 mL标准葡萄糖溶液加入容量瓶中,分别添加一定量蒸馏水定容摇匀。从上面得到的六只容量瓶中各自取1 mL溶液加入试管中,依次将0.6 mL 5%的苯酚溶液和3 mL浓硫酸加入试管中,振荡使它们充分混合均匀,然后把试管放入60℃水中开始恒温反应20 min,等待反应完毕后,停止加热,将试剂冷却至室温,把试剂样品放入分光光度计,选择波长为490 nm进行吸光度测量,结合测量数据绘制标准曲线,得到如下回归方程:

式中:A——吸光度

C——葡萄糖浓度, μg/mL

1.2.3 微波辅助萃取方法

将亚侧耳原材料干燥后粉碎经石油醚、乙醇脱脂,然后乙醇提取,去除其中的醇溶性杂质和单糖,过滤后残渣晾干备用,称取5 g除脂后的亚侧耳粉,加入规定用量的溶剂,静置一定时间润湿物料,然后恒温条件下微波提取一定时间,累计提取两次,抽滤提取剂,合并滤液,用旋转蒸发仪浓缩到原体积的1/5左右,除去蛋白质,醇沉后用无水乙醇淋洗,取出干燥得粗多糖。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验

2.1.1 提取时间对得率的影响

观察图1中曲线走势,不难发现当温度等其他因素保持不变时,微波提取时间不断变大,曲线持续上升,提取得率也在上升,提取时间到达10 min时,提取得率也随之到达最大值,发现提取时间超过10 min后,如果继续提取,时间并不影响亚侧耳多糖的提取得率,时间越长反而有所下滑,说明此时多糖已经基本完全溶解提取,时间过长多糖发生其他反应分解。因此10 min是多糖最佳的微波提取时间。

图1 提取时间对得率的影响Fig.1 Effect of extraction time on yield

2.1.2 液料比对得率的影响

图2 液料质量比对提取得率的影响Fig.2 Effect of liquid mass ratio on extraction yield

观察图2,当提取时间等其他条件保持不变时,当液料比逐渐上升的时候,亚侧耳多糖的得率也逐渐提高,在液料比为30∶1的时候达到最大值,继续增加液料比得率基本不变甚至有所下降,可能是液体量太多影响结果。因此经过多种考虑选择30∶1的液料比最佳。

2.1.3 提取温度对得率的影响

根据图3曲线走势不难发现,当温度为70℃时得率为峰值,表示此温度下多糖基本被全部提取。温度过高得率下降可能是多糖在高温下发生分解。因此微波提取的最佳温度为70℃。

图3 提取温度对提取得率的影响Fig.3 Effect of extraction time on yield

2.1.4 提取次数对得率的影响

由图4曲线走势可知,当提取次数为2时,得率已经接近最大值,次数增加得率缓慢上升后基本不变,表明提取两次已基本提取完全。因此微波提取的最佳提取次数为2。

图4 提取次数对得率的影响Fig.4 Effect of extraction times on yield

2.2 正交实验

表1 实验因素水平Table 1 Factor level of experiment

为了优化微波提取工艺,了解各因素之间相互关系和影响范围。将温度(A）、亚侧耳多糖的液料比(B）、亚侧耳多糖的微波提取次数(C）、亚侧耳多糖的提取时间(D）四个因素进行正交实验,选择使用L9(34）正交表。正交实验结束后,结合实验数据和正交表,判断提取得率和它们的关系,明确了影响因素的优先级顺序:A＞D＞C＞B,同时,联系社会生产实际过程,得到最佳提取工艺条件为 A3B3C2D2。即:设置提取温度为80℃,将亚侧耳多糖的液料比确定在35∶1,分别提取两次,每次都提取10 min,此时提取效果最佳。同时为了保证实验结果的准确性和可靠性,以正交实验得到的最佳工艺条件为基础进行平行试验,计算得率的平均值,结果为15.16%。由此可见,实验结果是可以再现的,有效的。

表2 正交实验设计表及结果Table 2 Orthogonal experiment chart and result

3 结 论

通过单因素实验和正交实验优化了提取工艺,本实验结果表明,在温度为80℃条件下,对液料比为35∶1的亚侧耳重复提取两次,每次10 min,此时的得率最高。相比传统方法,微波提取技术有效提升了亚侧耳多糖的提取率,同时可以缩短提取时间,简化提取工艺,在工业化生产过程中有一定指导作用。