辛伐他汀通过NFκ-B通路抑制破骨细胞的分化

于冬冬，赵丹阳，杨鸫祥，杨关林

（1.辽宁中医药大学附属医院骨科，沈阳 110032；2.沈阳市第一人民医院神经内科，沈阳 110041；3.辽宁中医药大学附属医院中西医结合内科，沈阳 110032）

绝经后骨质疏松症（postmenopasal osteoporosis，PMOP）是最常见的原发性骨质疏松症。在PMOP的发病过程中，破骨细胞过度活化同时伴随过度骨吸收［1］。临床目前应用的防治PMOP药物都存在一定程度的不良反应，而且没有一种抗骨质疏松药物能够完全恢复丢失的骨量［2］。

他汀类药物是临床治疗高脂血症的常用药物［3］。研究［4］发现，他汀类药物影响破骨细胞的分化及骨吸收，但具体的作用机制尚不明确。本研究试图阐明辛伐他汀对破骨细胞分化调节及其潜在机制，为临床防治PMOP提供新思路及研究依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞：小鼠单核/巨噬细胞RAW264.7（美国ATCC公司）。

1.1.2 试剂：辛伐他汀（Simvastatin，SIM，美国Sigma公司。溶于无水乙醇，储存浓度10-2mol/L，-20℃保存）；重组人可溶性RNAK配体（recombinant human soluble RANK Ligand，sRANKL，美国Peprotech公司）；重组人巨噬细胞集落刺激因子（recombinant human macrophage colony stimulating factor，M-CSF，美国Peprotech公司）；DMEM（美国Hychone公司）；胎牛血清（美国Hychone公司）；TRAP染色试剂盒（美国Sigma公司）；核因子κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）免疫荧光检测试剂盒（中国Beyotime公司）；WST-1检测试剂盒（中国Beyotime公司）；p65、p-p65一抗（美国Cell signaling公司）；鬼笔环肽检测试剂（美国AAT BiBe Questy公司）。

1.1.3 仪器：细胞孵箱（美国Thermo公司）；倒置相差显微镜（日本Olympus公司）；免疫荧光显微镜（日本Olympus公司）；流式细胞仪（美国BD公司）；AMR-100酶标仪（中国杭州奥盛仪器有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 小鼠单核/巨噬细胞RAW 264.7培养及诱导分化：RAW 264.7细胞在DMEM未分化培养基中培养（含10%胎牛血清、不含抗生素、37℃、5%CO2孵箱内培养，注意调节培养基的pH值，宁偏酸性勿碱性）。细胞接种于10 cm2培养板内，细胞传代可用胰酶，但一定要注意控制胰酶消化的时间。也可以用无菌枪头把细胞从贴壁的状态直接吹打成悬浮细胞。诱导分化培养基（DMEM、10%胎牛血清、15 ng/mL sRANKL、15 ng/mL M-CSF）继续培养7 d。

1.2.2 WST-1检测细胞增殖活性：研究分为对照组、10-5～10-9mol/L的SIM组。细胞以5×103/孔平铺于96孔平板中，24 h后更换诱导分化培养基，诱导培养基培养7 d后，细胞经SIM处理3、12、24、48 h，每孔加20 μL WST-1检测剂。在孵箱中孵育1 h。450 nm读取吸光度值。光密度（optical delnsity，OD）值=（处理后细胞OD值-对照组细胞OD值/N），n＞ 3。

1.2.3 TRAP染色检测破骨细胞分化：诱导分化培养基中加入不同浓度的sRANKL+M-SCF（0、5 ng/mL、15 ng/mL、50 ng/mL）诱导分化 7 d。TRAP染色根据Sigma试剂盒进行操作。分析SIM对成骨细胞分化影响的分析共分5组，分别为A组（对照组）、B组（sRANKL+M-SCF组）、C组（SIM+sRANKL+M-SCF组）、D组（PDTC+sRANKL+M-CSF）、E组（SIM+PDTC+sRANKL+M-CSF）。RAW264.7细胞（5×104/孔）在24孔板内培养，在含和不含SIM（10-6mol/L）的条件下进行诱导分化培养及药物干预。

1.2.4 肌动蛋白检测破骨细胞吸收活性：吸收活性检测分为4组。A组（对照组）、B组（sRANKL+MSCF组）、C组（SIM+sRANKL+M-SCF组）和D组（PDTC+sRANKL+M-CSF组）。RAW264.7细胞（5×104细胞/孔）在24孔板内培养，在含和不含SIM（10-6mol/L）的条件下诱导分化7 d。用免疫固定液在室温下固定15 min，用免疫洗涤液（含0.1%的Triton X-100）在冰上冲洗3 min后，用鬼笔环肽检测试剂染色40 min，用DAPI溶液染色细胞核5 min。使用共焦显微镜拍照。使用滤光器鬼笔环肽检测试剂（激发：492 nm；发射：518 nm）。

1.2.5 免疫荧光检测NF-κB核转位：免疫荧光检测共分为4组。A组（对照组）、B组（sRANKL+M-SCF组）、C组（SIM+sRANKL+M-SCF组）、D组PDTC+sRANKL+M-CSF组。细胞在盖玻片上并培养过夜，在含和不含SIM（10-6mol/L）的条件下诱导分化7 d。细胞固定后，用p-p65抗体孵育细胞（以1 ∶400的比例稀释）过夜，用DAPI染色细胞核（5 min），免疫荧光显微镜检测。

1.2.6 Western blotting检测：分别用sRANKL+M-SCF和SIM+sRANKL+M-SCF进行处理。细胞在含和不含SIM（10-6mol/L）的条件下诱导分化7 d。提取蛋白，定量，上样，蛋白电泳，转膜，封闭，一抗孵育过夜，二抗标记，ECL发光法曝光成像。Image J软件测定平均灰度值，与内参值进行标准化后进行统计分析。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 SIM抑制RAW264.7细胞增殖活性

采用WST-1方法对RAW264.7细胞增殖活性进行检测，结果显示，SIM（10-5mol/L、10-6mol/L）均能抑制破骨细胞的增殖活性，但是SIM（10-6mol/L）作用24 h、48 h能稳定抑制RAW264.7细胞的增殖活性。因此，SIM（10-6mol/L）作用24 h作为实验用药浓度及作用时间。见表1。

2.2 破骨细胞的形态学观察

未分化的RAW264.7细胞呈圆形，透光度好，边界清晰。加入诱导液后，细胞触角逐渐增多，细胞略呈短梭形，细胞透光度下降，继而细胞融合成巨大的多核破骨细胞（细胞核数≥3）（B组破骨细胞数量44%±0.15%），加入SIM（C组破骨细胞数量18%±0.12%，P=0.004）及PDTC（D组破骨细胞数量33%±0.23%，P=0.034）后，破骨细胞的分化受到抑制，融合的破骨细胞数量明显减少，SIM+PDTC组（E组破骨细胞数量21%±0.12%，P=0.064）的作用效果与单独SIM组及PDTC相似。见图1。

表1 SIM对RAW264.7细胞增殖活性的影响（±s，n=6）Tab.1 Effect of SIM on RAW264.7 cell proliferation（±s，n=6）

表1 SIM对RAW264.7细胞增殖活性的影响（±s，n=6）Tab.1 Effect of SIM on RAW264.7 cell proliferation（±s，n=6）

1）compared with control group，P ＜ 0.05.

2.3 TRAP染色检测破骨细胞分化

图1 SIM抑制破骨细胞形成 ×200Fig.1 SIM inhibited osteoclast formation ×200

TRAP检测不同浓度的sRANKL+M-CSF对破骨细胞分化的影响，RAW264.7细胞在不同浓度的sRANKL+M-CSF诱导分化7 d，结果按破骨细胞数（细胞核数≥3）/总细胞数来确定破骨细胞的分化效果。对照组没有破骨细胞分化，5 ng/mL 组为8%±0.15%，15 ng/mL 组为40%±1.5%，而50 ng/mL组为。其中，浓度为15 ng/mL组的sRANKL+M-CSF具有最大的诱导RAW264.7细胞向破骨细胞分化的效果。因此，将浓度为15 ng/mL的sRANKL+M-CSF诱导分化7 d作为本研究诱导分化的浓度及时间。见图2。

2.4 SIM抑制破骨细胞的分化

RAW264.7细胞在15 ng/mL的sRANKL+M-CSF诱导分化7 d，结果按破骨细胞数核细胞）/总细胞数确定破骨细胞的分化效果，在诱导分化培养基中单独加入SIM（10-6mol/L，C组破骨细胞数为18%±0.12%）及PDTC（10-5mol/L，D组破骨细胞数为35%±0.13%，B组破骨细胞数为48%±0.25%）和SIM+PDTC（20%±0.11%）的情况下，破骨细胞的分化受到抑制，SIM+PDTC组的一致分化效果与单独SIM组及PDTC相似（P＞ 0.05）。见图3。

图2 不同浓度的sRANKL+M-CSF诱导破骨细胞分化 ×200Fig.2 Osteoclast differentiation induced by different concentrations of sRANKL+M-CSF ×200

2.5 SIM抑制破骨细胞肌动蛋白环的形成

图3 SIM抑制破骨细胞的分化 ×200Fig.3 SIM inhibits osteoclast differentiation ×200

用荧光显微镜检测肌动蛋白环，以观察成熟的破骨细胞肌动蛋白环的结构。sRANKL+M-CSF能够诱导明显诱导肌动蛋白环的形成（B组：41%±0.15%），SIM能够抑制肌动蛋白环的形成（C组：10%±0.08%），加入PDTC后的作用效果与SIM相似（D组：11%±0.13%）。见图4。

2.6 SIM抑制NF-κB的核转位

免疫荧光检测结果显示，破骨细胞分化后，p65向细胞核内转位，SIM能够抑制其向细胞核内转位。见图5。

图4 SIM抑制破骨细胞肌动蛋白环的形成Fig.4 SIM inhibits actin ring formation in osteoclasts

2.7 Westerm blotting结果

进一步分析SIM抑制成骨细胞分化的潜在机制，免疫印迹检测通路蛋白显示，sRANKL+MCSF能促进细胞核内p65的磷酸化（0 min，5 min，30 min，60 min），尤以60 min时p65磷酸化明显，加入SIM后p65的细胞核内转位受到抑制，60 min时抑制效果明显，提示SIM发挥其抑制破骨细胞分化的药效学机制是通过抑制NF-κB信号通路完成的（P＜0.05）。见图6。

图5 SIM抑制p65细胞核内转位Fig.5 SIM inhibits intranuclear translocation of p65 in cells

图6 SIM抑制p65磷酸化Fig.6 SIM inhibits p65 phosphorylation

3 讨论

PMOP与雌激素缺乏密切相关，具有骨质疏松症的一般特征，如骨小梁结构破坏和骨折风险增加［5］。研究［6-8］表明，雌激素能抑制破骨细胞的形成。在PMOP的发病过程中，过度激活破骨细胞形成和过度骨吸收是一个重要的因素，因此，抑制破骨细胞分化仍是PMOP治疗的一个重要策略。

他汀类药物具有抗血栓、抗氧化和抗炎和多效性的治疗作用。研究［9］表明，他汀类药物对骨骼具有一定的药理学作用。还有研究［10-11］表明，他汀类药物增加了卵巢切除的骨形成、抑制破骨细胞生成，但其潜在机制尚不清楚。

本研究揭示了辛伐他汀抑制破骨细胞分化的潜能，TRAP染色检测显示，辛伐他汀抑制sRANKL和M-CSF诱导的RAW264.7细胞向破骨细胞的形成和分化。破骨细胞形成过程中，细胞骨架重排导致肌动蛋白环的形成。这些肌动蛋白环在维持细胞结构中起着至关重要的作用［12］。F-肌动蛋白环检测结果表明，辛伐他汀能够抑制破骨细胞吸收活性，这对预防和治疗PMOP具有重要意义。

NF-κB信号通路是调节破骨细胞成熟、分化、凋亡的重要通路［13］，进一步研究辛伐他汀发挥抑制破骨细胞分化的潜在机制。结果显示，辛伐他汀抑制NF-κB通路的核心蛋白p65的激活，抑制p65的细胞核内转位，进而抑制破骨细胞的分化。因此，本研究为临床应用辛伐他汀防治PMOP提供了依据。