TMEM206促进表皮生长因子诱导的结直肠癌上皮-间质转化

郑启智，赵劲博，盛伟伟，周建平，董明

（中国医科大学附属第一医院胃肠外科/疝外科，沈阳 110001）

结直肠癌是最常见的恶性肿瘤和癌症相关死亡原因之一，目前在全世界范围内其发病率和死亡率仍较高［1］。结直肠癌的发生、发展是一个多基因、多阶段、长期形成的复杂病变过程，局部侵袭和远处转移是导致结直肠癌患者死亡的最重要因素［2］。上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）被认为是影响结直肠癌侵袭、转移的重要作用机制之一。生长因子如转化生长因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）、表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）等介导EMT的发生，同时TGF-β、Wnt、Notch等多种信号通路相互交错调控EMT的过程［3］。跨膜蛋白（transmembrane protein，TMEM）家族成员被证实在肿瘤发生、发展中起重要作用［4-5］。而本课题组前期研究［6］表明，TMEM206过表达可通过与AKT和细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）信号通路相互作用，促进结直肠癌的恶性进展。本研究的目的是探讨TMEM206影响结直肠癌EMT的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

人结直肠癌细胞系HCT116和SW480（中科院上海细胞库），TMEM206兔抗人多克隆抗体（英国Abcam公司），pCMV6、pCMV6-Myc-DDK-206（RC202838）（美国OriGene公司），Lipofectamine 3000（美国Invitrogen公司），PVDF膜（美国Millipore公司），p-ERK和c-Myc抗体（美国Cell Signaling Technology公司），纤连蛋白（Fibronectin）、Zeb1、E-钙黏蛋白（E-cadherin）、N-钙黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、Snail1、Snail2和β-actin抗体（美国Proteintech公司），二抗（中国中杉金桥），IgG抗体（美国Santa Cruz公司），磁珠（美国Bio-Rad公司），EGF（美国Proteintech公司），牛血清白蛋白（美国Sigma公司），24孔板（美国Corning Costar公司），基质胶（美国BD Biosciences公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养：HCT116、SW480细胞均使用RPMI 1640培养基（含10%胎牛血清和100 IU/mL青-链霉素），置于37 ℃、5%CO2的孵箱中培养，隔天消化传代。

1.2.2 细胞转染：用Lipofectamine 3000等相关转染试剂作为溶液，分别使用TMEM206质粒和NC-PCMV6空载质粒对HCT116、SW480细胞进行转染，将细胞分为TMEM206（206组）和对照组（NC组）。将2种细胞接种至6孔板后，在细胞密度约为60%时，将相容的质粒和Lipofectamine 3000、p3000加入，细胞培养8 h后用于其他实验。

1.2.3 EMT构建：质粒转染后的2种细胞用50 ng/mL EGF在48～72 h内处理2次。使用1%牛血清白蛋白为对照，分为NC组、206组、NC+EGF组和206+EGF组，用含有1%胎牛血清的推荐生长培养基培养细胞，以增强EGF的作用。

1.2.4 Western blotting：收集进行上述EMT构建后的HCT116、SW480细胞，提取总蛋白。通过10% SDSPAGE分离样品蛋白，并转移至PVDF膜。然后将膜置于5%脱脂奶粉中封闭2 h。与TMEM206、p-ERK、c-Myc、Fibronectin、Zeb1、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Snail1、Snail2和β-actin抗体在4 ℃孵育过夜。之后将膜与二抗在室温下孵育2 h。ECL发光方法检测蛋白条带，运用Image J软件分析各条带灰度值。该实验重复3次。

1.2.5 侵袭和迁移实验（Transwell实验）：在24孔板中进行细胞侵袭和迁移测定。将转染后细胞的密度调整为2×105/孔，将上述EMT构建中的NC组、206组、NC+EGF组 和206+EGF组 的HCT116及SW480细胞接种到小室中。将300 μL细胞悬液接种到上室中，下室中加入600 μL含有20%胎牛血清的RPMI 1640培养基。侵袭实验中上室用200 mg/mL基质胶包被，其余同迁移实验，37 ℃下孵育3 h后进行侵袭测定。24 h后取出小室，冰甲醇固定30 min，0.1%结晶紫染色30 min。每孔任意选取3个视野（200×）获得细胞图像。结果表示为每个视野迁移的细胞数。每个实验重复3次。

1.2.6 免疫共沉淀：TMEM206质粒转染细胞以增加其表达。48 h后提取蛋白。将质粒标签Myc-tag和IgG抗体与磁珠室温孵育1 h后，将磁珠与样品蛋白在4 ℃孵育过夜。煮沸样品后用于SDS-PAGE，然后进行Western blotting分析。

1.3 统计学分析

应用SPSS 19.0软件进行统计学分析。计量数据均通过3次以上的独立实验获得。Western blotting、细胞迁移和侵袭测定结果用±s表示，采用t检验进行比较。P＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TMEM206过表达促进EGF诱导的EMT样细胞形态

EGF诱导后，HCT116和SW480细胞均表现出EMT样细胞形态：大多数细胞丧失其上皮特征并呈现纺锤形和成纤维细胞样形态（图1）。同时发现，TMEM206上调增强了EGF诱导的EMT样细胞形态。大多数HCT116细胞中，206+EGF组细胞较206组细胞出现了明显的细胞形态改变，纺锤形和成纤维细胞样形态更为显著（图1）。SW480细胞中，这种促进作用更为明显。

2.2 TMEM206过表达促进EGF诱导2种结直肠癌细胞中EMT相关蛋白表达的变化

图1 转染质粒、EGF处理后结直肠癌细胞的形态 ×100Fig.1 Cell morphology of plasmid-transfected colorectal cancer cells after EGF treatment ×100

对比2种细胞转染后的NC组、206组、NC+EGF组和206+EGF组EMT相关蛋白表达的变化，结果发现，EGF显著诱导2种细胞中E-cadherin减少以及Fibronectin、Vimentin、Zeb1、N-cadherin、Snail1、Snail2蛋白增加。然而，TMEM206过表达部分促进了EGF诱导的EMT相关蛋白变化，包括促进EGF诱导的E-cadherin减少以及Fibronectin、Zeb1、Snail1、Snail2蛋白增加（Vimentin和N-cadherin除外）。见图2。

2.3 TMEM206过表达在2种结直肠癌细胞中促进EGF激活的ERK/MAPK-cMyc信号传导

EGF在HCT116和SW480细胞中显著激活ERK/MAPK-cMyc信号传导，随后pERK和c-Myc蛋白表达增加（图2）。无EGF刺激下，单独TMEM206过表达不影响相关蛋白表达。然而，TMEM206过表达促进了EGF诱导的pERK和c-Myc蛋白增加（图2）。上述结果提示，TMEM206和ERK/MAPK-cMyc信号通路特异性相互作用。

另外，TMEM206过表达部分上调EGFR-ERK/MAPK-c-Myc信号传导的关键蛋白，包括Fibronectin、c-Myc和p-ERK（图2）。接下来，通过免疫共沉淀测定来证实这些结果。结果显示，TMEM206与c-Myc和E-cadherin免疫共沉淀（图3）。但TMEM206并不与ERK直接结合，这与之前的共沉淀结果一致。结果表明，结直肠癌细胞中TMEM206和EGF诱导的EGFR-ERK/MAPK-c-Myc信号通路之间相互作用。

2.4 TMEM206过表达促进EGF增强的结直肠癌细胞侵袭和迁移

EMT在结直肠癌细胞的侵袭和转移中具有重要作用，EGF能够显著增强结直肠癌细胞的侵袭和迁移。本研究发现，TMEM206过表达质粒转染HCT116细胞后的206组细胞，其侵袭和迁移能力明显增强。同时，TMEM206过表达进一步促进了EGF增强的细胞侵袭和迁移。EGF诱导后，与NC+EGF组相比，206+EGF组中细胞侵袭和迁移明显增加。结果提示，TMEM206过表达促进了结直肠癌细胞中EGF诱导的EMT。在SW480细胞中发现了同样的现象。见图4。

3 讨论

TMEM206是TMEM家族成员，在神经、肾脏和肠道组织中高度表达。之前的研究［6］表明，TMEM206在结直肠癌组织中上调，其表达与T分期和UICC分期呈正相关，与结直肠癌分化呈负相关。TMEM206能够增加结直肠癌细胞系中的p-AKT水平，而AKT在肿瘤增殖、侵袭和迁移中起重要调节作用［7-8］，同时，p-ERK（p44/p42）也明显变化，其参与Ras/Raf/MEK/ERK途径［9］。进入细胞核的ERK活性形式作用于各种转录因子，参与细胞分化、增殖和转移的调节［10-11］，在肿瘤EMT中也起着重要作用。

图2 转染质粒、EGF处理后结直肠癌细胞中EMT和EGFR-ERK/MAPK信号传导相关蛋白表达的变化Fig.2 Changes in the expression of EMT and EGFR-ERK/MAPK signaling-related proteins in plasmid-transfected colorectal cancer cells after EGF treatment

图3 通过免疫共沉淀检测Myc-tag、E-cadherin和c-Myc之间的相互作用Fig.3 Interaction between Myc-tag，E-cadherin，and c-Myc as observed by immunoprecipitation

图4 转染质粒、EGF处理后结直肠癌细胞的侵袭和迁移能力 ×200Fig.4 Invasion and migration of plasmid-transfected colorectal cancer cells after EGF treatment ×200

本研究探讨了TMEM206在结直肠癌中对EMT的作用。在EMT过程中，上皮细胞标志蛋白E-cadherin表达下调，Vimentin、Snail、Slug及其他间质特性蛋白表达上调［12-13］，导致细胞极性改变、细胞骨架重建以及细胞间黏附丧失，从而使细胞获得高迁移、高侵袭、抗凋亡等间质表型特征。本研究首次发现，TMEM206过表达促进EGF诱导的2种结直肠癌细胞系中的EMT。众所周知，EMT（从E-cadherin减少的良性至浸润性癌的初始转化）和间充质-上皮细胞转化被认为是癌症转移的关键事件。TMEM206过度表达促进了结直肠癌中EGF诱导的EMT相关蛋白（E-cadherin、Fibronectin）的变化，进一步表明TMEM206还在结直肠癌中EGF诱导的EMT中起重要作用。

本研究中，EGF在结直肠癌细胞中激活EGFRERK/MAPK-c-Myc信号通路，而TMEM206过表达促进了EGF诱导的p-ERK和c-Myc蛋白增加，同时也促进了EMT相关蛋白的改变，如E-cadherin减少，Fibronectin、Zeb1、Snail1、Snail2增加。功能学实验也表明，TMEM206过表达进一步增强了EGF对结直肠癌细胞侵袭和迁移能力的诱导。上述指标均表 明，TMEM206与EGFR-ERK/MAPK-c-Myc信号通路在EGF诱导的EMT中发生了密切的相互作用。可以得出结论，TMEM206通过ERK/MAPK-c-Myc信号通路促进结直肠癌细胞中EGF诱导的EMT。而EGFR-ERK/MAPK-c-Myc信号通路也具有重要的抗癌药物，通过Smad2阻断转化生长因子-β信号通路的激活来抑制纤维连接蛋白原纤维形成，减少细胞迁移并最终抑制结直肠癌中EMT［14］。综合之前的研究，TMEM206和ERK/MAPK-c-Myc信号通路协同作用促进结直肠癌的侵袭和转移。当然，还需进一步研究其中相应的分子机制。

此外，越来越多的证据表明，各种癌细胞中Ca2+细胞内稳态的改变与肿瘤的发生、进展和转移密切相关。Ca2+传感器钙调蛋白以Ca2+依赖性方式增强Myc转录和致癌活性［15］。所以，TMEM206与肿瘤细胞内Ca2+的关系也需进一步明确，未来的研究将进一步探讨。这些结果有望为结直肠癌的治疗、预后评估和新靶向治疗药物的开发提供新的理论和实验基础。

综上所述，本研究结果为TMEM206在结直肠癌中的潜在作用提供了重要的依据。虽然结直肠癌的预后优于其他类型癌症，但其远处转移极大地影响了一些结直肠癌患者的预后。因此，研究TMEM206在鉴定新型靶向治疗或良好的诊断标志物中的作用至关重要。