禽流感血凝抑制试验体会

白 翠，李海燕，郑 聪，刁鹏翔，王 晋

1.吉林省动物疫病预防控制中心，吉林长春 130062；2.吉林省通化市二道江区畜牧兽医总站，吉林通化 134000；3.吉林市龙潭区江北乡畜牧兽医站，吉林吉林市 132000；4.吉林市昌邑区两家子乡畜牧兽医站，吉林吉林市 132000

禽流感血凝和血凝抑制试验是禽流感抗体检测常用的实验。免疫抗体的监测工作对禽流感的防控工作有重要的意义。

1 血凝和血凝抑制的定义

血凝是某种病毒能够使某种动物的红细胞发生凝集的现象。它在血凝抑制试验中，用于4单位抗原的测定和抗原回归试验。

血凝抑制是当病毒悬液中加入了特异性的抗体，这种抗体的量完全能够抑制病毒凝集红细胞的现象。

2 试验前各种试剂的准备

2.1 阿氏液和PBS

2.1.1 阿氏液

阿氏液最好是现用现配，也可以提前配好高压灭菌后备用。

2.1.2 PBS

PBS可以按照试剂说明书或者实验室存放的指导手册自行配置，并进行pH的测量。

为了方便实用，操作准确，市场上也有成品的液体，还有配制好的粉末（只需按照说明溶于蒸馏水中即可）。这两种都建议使用，省去我们各种配置环节。对于成本而言，粉末状的更便宜些，适合大量操作样品的实验室使用。

2.2 1%红细胞

为防止溶血和不同个体鸡只对HI效价的影响，一般采取3只或3只以上的SPF公鸡，采血后不可随意上下左右摇晃采血管，分离后的血清冷藏保存，一般不要超过24 h。洗涤红细胞过程中，要用PBS缓慢吹吸，力度均匀，不可用力过猛。离心的转数不超过2 000 r/min，转数过高会引起溶血现象。

有部分文献表明，洗涤液PBS要好于生理盐水，因为PBS有对其它酸碱物质缓冲的能力，可以维持反应体系的pH值，而生理盐水不具备这种缓冲的作用。

还有的操作人员，误把纯净水当成洗涤液，造成不必要的结果，所以我们在洗涤前要做好各种试剂的准备工作。

3 血凝试验抗体效价的判定

抗体效价首先要确定4单位抗原。4单位抗原的配制，是通过血凝试验来实现的。抗原的效价是血凝抑制试验中重要的一项，它的准确度直接影响着最后结果的判定。测定效价时，可以2人同时进行测定，每个稀释倍数都做复孔。测定好血凝效价后，最好要做个抗原回归试验，以消除血凝试验中，试验人员和试验操作中的误差和不足。

4 血凝抑制结果判定

每个试验是否成功的标准是看它的阴性和阳性血清对照。所以每次试验都要设立阴阳性对照。在对照正确的情况下，将反应板倾斜，从背面观察红细胞凝集情况，也就是“流泪”状况。泪滴长度对时间有要求，所以判断时间要迅速，当阳性血清反应后，就开始观察。一般在室温条件下30～40 min出结果。

血凝和血凝抑制试验是检测禽流感病毒抗体最常用的方法，由于操作简单，涉及到的实验仪器设备又很少，所以被广为应用。但由于它的判断方式是以肉眼为准，所以在判断结果上是“仁者见仁智者见智”，这是该实验的误差所在。我们要熟练掌握该实验的操作方法，用校准过的移液器、标准的V底反应板、无溶血的红细胞和“可信赖”的操作人员，当然我们还要用采样标准的样品血清，这样我们的结果就会很理想、很清晰。