猪流行性腹泻病毒氨基肽酶N受体研究进展

宋利娜，刘沂霖，任 锐，苏 双，尹荣兰*

1.吉林大学动物医学院，吉林长春 130062；2.吉林省畜牧兽医科学研究院，吉林长春 130062

猪流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒引起的一种仔猪急性水样腹泻、呕吐、脱水导致电解质失衡而死亡的一种疾病。1978年比利时根特大学科学家根据科赫原则首次证明冠状病毒为猪病毒腹泻的病原。1982年PEDV首次在亚洲报道，2012年，PEDV再次席卷中国，与欧洲猪场病症相比，亚洲猪场仔猪致死率更高，且流行较广。2013年美国首次报道该病发生，一年内造成800万头仔猪病死，并迅速传至加拿大和墨西哥，随后PEDV在亚洲其他国家爆发，如韩国、日本。

1 PEDV结构

PEDV为直径95～190 nm的冠状病毒属α冠状病毒科病毒，PEDV基因组约为28 kb的单股正链RNA，包括5’帽子和3’poly尾巴，5’UTR和3’UTR及7个开放阅读框，包括四个结构蛋白（纤突蛋白S、囊膜蛋白E、膜蛋白M和核衣壳蛋白N），其中S蛋白与宿主靶细胞受体结合介导病毒入侵和诱导产生中和抗体。

病毒与细胞受体的相互作用作为病毒生命周期的第一步，也是至关重要的一步，病毒与受体结合使病毒进入细胞复制增殖。冠状病毒科包含多种重要的病毒，感染谱较广，感染人类和动物，引起呼吸道和肠胃疾病。冠状病毒有多种细胞受体已被鉴定，包括癌胚抗原相关细胞粘附分子1、血管紧张素转换酶2和氨基肽酶N(APN)。例如，α冠状病毒属人类冠状病毒NL63使用血管紧张素转换酶2作为其进入细胞的受体。ACE2受体较早被鉴定为β冠状病毒属急性呼吸综合征冠状病毒的功能性受体。鼠肝炎病毒和中东呼吸综合征冠状病毒通过与癌胚抗原细胞粘附分子和双肽酶4结合介导病毒感染。一些冠状病毒，包括人类冠状病毒OC43和牛冠状病毒使用乙酰化唾液酸作为受体介导病毒入侵感染。

2 氨基肽酶N (APN)

氨基肽酶N作α冠状病毒的主要受体，如猪传染性胃肠炎病毒，人类α冠状病毒229E，猫传染性腹膜炎病毒和犬冠状病毒利用氨肽酶N作为受体。PEDV利用APN作为一种细胞受体介导病毒入侵感染。受体结合和进入细胞是病毒感染宿主细胞的必要步骤，导致病毒内化，促进病毒增殖复制。PEDV的宿主特异性、组织嗜性是由病毒的S蛋白与受体相互作用决定的。受体相互作用在冠状病毒的细胞和组织嗜性以及发病机制和跨物种传播中起着至关重要的作用。

2.1 氨基肽酶N的结构

氨基肽酶N是一种II型锌金属蛋白酶，APN糖蛋白主要表达在肾脏、小肠、呼吸道上皮细胞上，可以被胰蛋白酶裂解成N端(95 kDa)和C端(50 kDa)两个蛋白，APN是一种锌依赖的蛋白酶，通过HELAH基序介导活性肽的N端氨基酸的分裂，以发挥酶的活性。APN还发挥着受体和信号分子的作用。PEDV感染细胞中，金属蛋白酶ADAM17通过改变氨基肽酶N调节猪流行性腹泻病毒感染。APN有7个结构域，第一个结构域在N端(aa17)上形成一个短的细胞质尾部，结构IV从71～252 aa，肽酶活性由域V和域VI(253～558 aa)所包含。VII域位于C端的由 581～967 aa组成的。

2.2 APN与PEDV感染

APN介导多种生命过程，包括抗原呈递、细胞分化、细胞运动和冠状病毒进入。猪APN在肠道刷状缘膜上大量表达。此外，它还表达在肾脏和呼吸道的上皮细胞表面。pAPN最初被确定为猪传染性胃肠炎病毒的主要受体。在猪体内，体外转染和表达pAPN可以使MDCK细胞株感染PEDV，说明pAPN可能也是PEDV的受体。此外，将pAPN使用CRISPRCas9技术将其转入至小鼠体内，小鼠对PEDV具有易感性。MDCK细胞外源表达hAPN或pAPN使其具有易感性，提示PEDV-APN相互作用不具有物种特异性。此外，PEDV可以感染人、猴、猪、蝙蝠等多种细胞系。Vero细胞常被用于PEDV毒株的分离和繁殖，然而，Vero细胞蛋白组质谱分析并无APN表达，细胞中缺乏mRNA转录本，这表明其他受体可能参与了PEDV进入细胞。有学者质疑pAPN作为功能受体的作用。最新研究表明，APN不是PEDV进入病毒所必须的受体。到目前为止，尚缺乏直接证据表明在体外pAPN与PEDV S蛋白相互作用。虽然背后的机制尚未被破译，但人们很容易推测，pAPN的表达水平可能与PEDV感染有关。

2.3 APN与冠状病毒感染

冠状病毒利用多种细胞蛋白作为细胞进入的功能受体，例如锚定在S蛋白介导冠状病毒进入细胞。S蛋白裂解成受体结合S1亚基和膜融合S2亚基组成。S1亚基中的两个区域，称为S1-NTD和S1-CTD，在一些冠状病毒中可能作为受体结合区域，APN结合域最近被证明位于PEDV S1的c端半区域(aa477～629)，对应于TGEV S1的RBD(aa505～655)。有趣的是，尽管被认为共享同一受体，但在已知对APN结合起关键作用的TGEV RBD延伸环内的两个芳香残基在PEDV RBD中并未保守，这表明受体相互作用的模式不同。

2.4 APN与跨种传播

与TGEV不同，PEDV与hAPN相互作用并利用hAPN作为受体。此外，PEDV还可以在体外感染除猪外的不同物种的多个细胞系，包括蝙蝠和灵长类动物(人类和非人类)。PEDV的基因组序列和基因组与蝙蝠α-冠状病毒的关系要大于与同一属的其他病毒的关系，这表明蝙蝠和猪之间可能已经发生了跨种传播，可能是通过其他的中间宿主。

3 PEDV 与其他受体

除了与APN相互作用外，PEDV还能与唾液酸结合。α-冠状病毒、β冠状病毒、γ冠状病毒都可以结合唾液酸。研究表明，PEDV的唾液酸结合位点被证明发生在S蛋白的N端区域(aa1～320)，这一发现与其他冠状病毒唾液酸结合位点一致。然而，目前尚不清楚S蛋白结合唾液酸是否能促进PEDV进入细胞。APN招募TGEV S1能通过其N端区(aa21～244)与唾液酸(N-乙酰神经氨酸，Neu5Ac)和N-糖基神经氨酸结合。唾液酸结合活性在细胞培养中对TGEV在较短的接种条件下会增强感染。使用家兔红细胞证实PEDV具有血凝(HA)活性，但这种HA活性仅在用胰蛋白酶或神经氨酸酶预处理病毒后才能观察到。研究证明PEDV S1可以与牛和猪的黏液结合。此外，N-乙酰神经氨酸/唾液酸对PEDV S1表现出最高的结合亲和力。还有研究表明硫酸肝素作为S蛋白的结合位点协助病毒进入。其是否可作为功能受体介导病毒进入有待确定。

4 总结

受体相互作用在冠状病毒的细胞和组织嗜性以及发病机制和跨物种传播中起着至关重要的作用。APN作为α-冠状病毒的受体，其作用机制仍然不清楚，现有研究已证明其不是PEDV感染Vero和小肠上皮细胞所必须的功能受体。可能存在着其他的功能受体，研究表明，整合素蛋白和转铁蛋白受体蛋白均在PEDV感染过程中明显增加，是否可以作为PEDV的功能受体有待研究证实，所以了解APN的结构功能为PEDV的功能受体鉴定及疫苗的研发奠定基础。

参考文献：略