云南玛咖中多糖提取条件的研究

项浩特，王金琴，许 莹，陈 芮

（云南师范大学化学化工学院，云南 昆明 650500）

多糖是指由10个以上单糖通过糖苷键连接而成的聚糖。玛咖多糖作为玛咖的有效成分之一，具有重要的抗氧化活性。如玛咖多糖可以清除 DPPH·(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基)、·OH(羟基自由基) 和O2-(超氧阴离子自由基)，对·OH具有显著的抑制作用，但对O2-抑制率不高；玛咖多糖在体外可显著抑制CCl4引起的肝脏脂质过氧化反应的发生，减少MDA(丙二醛)的产生，其抗氧化作用与Vc(维生素c)相似[1-3]。玛咖多糖还可通过提高机体SOD(超氧化歧化酶)活力、降低MDA含量、减少自由基堆积，加速体内脂质过氧化物的及时清除，从而起到延缓和抗疲劳的作用[4-6]。

玛咖多糖的生物活性引起了研究者极大的兴趣。陈艳青报道了提取温度、提取时间、固液比等因素对采用水提醇沉法提取玛咖多糖的提取率的影响[7]。浦跃武等首先比较了超声波、热水和微波法提取玛咖多糖的效果及液料比、温度、时间、功率等因素对提取玛咖多糖的影响，最后采用正交实验得到超声波提取玛咖多糖的最佳工艺条件[2]。陈燕文等研究了分步醇沉法对玛咖多糖的单糖组成及抗氧化活性的影响[4]。徐娟等报道了提取温度、超声时间、料液比对黑玛咖中多糖得率的影响[8]。

本文采用红外光谱法研究了提取温度和时间对水提醇沉法得到的玛咖多糖结构的影响；采用紫外-可见吸收光谱法研究了提取温度和时间对玛咖多糖提取率的影响，得到了提取玛咖多糖最佳的实验条件。该研究思路为玛咖多糖进一步分离纯化及结构研究提供了参考。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

UV-8000s型紫外-可见分光光度计（上海菁海仪器有限公司）；ALPHA-Ⅱ型红谱仪（德国布鲁克·道尔顿公司）。

1.2 试剂

本实验所用到的试剂均为分析纯；所用香格里拉玛咖购于云南省昆明市丰熙茶行。

2 实验方法

2.1 玛咖多糖的提取

称取玛咖块根粉末10 g，按1∶20 (w/v)的比例加入蒸馏水在不同温度和时间进行提取，随后离心分离提取液。将上层清液浓缩至原来体积的1/5，冷却。用pH=7.4的磷酸盐缓冲液调节pH至7，加入0.4 g α-淀粉酶。于60℃水浴中酶解4h后，迅速升温至100℃灭酶5min，离心分离沉淀。在上清液中加入乙醇溶液至乙醇浓度为80%，在4℃下沉淀12h，得棕黄色的沉淀。沉淀溶于40mL蒸馏水中，用Sevag法除蛋白后再醇析一次，将得到的沉淀用乙醚、丙酮各洗涤2次。将沉淀于50℃真空干燥5h，即得玛咖多糖。

Sevag法除蛋白：移取玛咖多糖溶液100mL，按5:1的体积比加入三氯甲烷-正丁醇混合液，振摇30min，经离心分离后吸取上清液。重复此过程，直至玛咖多糖稀释液在260～280 nm没有吸收峰出现，即表明提取物中的蛋白质已除尽。

2.2 定性分析

采用压片法将玛咖多糖粉末和KBr在压片机上压成薄片，在红外光谱仪上进行测试，测试的波数范围为 600～4000cm-1。

2.3 定量分析

2.3.1 标准曲线的绘制

精密配制0.1 mg/mL标准葡萄糖液，从中取0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4mL 于 25mL 比色管中，再补足水分至2.4mL，加入6%的苯酚溶液1mL和浓硫酸 5mL，煮沸 15min。水中冷却5min。以2.4mL水作为空白按照同样的方法操作，用1cm比色皿于490nm处测吸光度A值。以浓度c为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线。

2.3.2 换算因子的测定

精密称取玛咖多糖2mg，定容至500mL，摇匀。精密吸取2.0mL按绘制标准曲线的方法测吸光度。

2.3.3 玛咖多糖含量的测定

精确称取玛咖粉末0.05000g，按1∶20的比例加入蒸馏水。在60℃下，超声提取20min后，离心分离清液，洗涤沉淀1次，合并滤液，过滤并定容至100mL。再移取4mL稀释后的滤液定容至10mL。移取1mL置于25mL比色管中，加入1.0mL6%的苯酚溶液和5mL浓硫酸混匀后煮沸15min显色，冷却5min后，于490nm下测定吸光度值。

3 结果与讨论

3.1 红外光谱法分析

采用红外光谱法考察了提取温度和时间对提取得到的玛咖多糖结构的影响。图1给出了90℃下不同提取时间时得到的玛咖多糖的红外光谱图。

结果表明：采用该法得到的样品在1116.06cm-1处存在很强的C-O-C单键不对称伸缩振动吸收峰；在1407.30cm-1处存在O-H单键面内弯曲振动吸收峰,这表明样品中含有-COOH。在1625.87cm-1处有很强的C=O双键伸缩振动吸收峰；在2936.56cm-1处有-CH2-不对称伸缩振动吸收峰；在3381.73cm-1处有很强的聚合物的OH单键的伸缩振动吸收峰。另外，样品在539.57cm-1和620.67cm-1的吸收峰对应于C-O单键的伸缩振动及各种基团的面内变形振动。从图中可知：提取温度90℃，提取1h～3h时，得到的玛咖多糖的红外吸收光谱图相似。

图1 在90 oC不同提取时间时得到的玛咖多糖的红外光谱

图2给出了温度分别为70℃和90℃时提取时间为2h得到的玛咖多糖的红外光谱图。由图2可知：这两种温度下得到的玛咖多糖的红外吸收光谱图相似。结果表明，提取温度在70～90℃时，得到的玛咖多糖的结构不随提取温度变化而发生变化。

图2 提取时间2h不同提取温度时玛咖多糖的红外光谱

3.2 紫外吸收光谱法分析

采用紫外吸收光谱法分析了不同提取温度和时间对玛咖多糖提取率的影响。

3.2.1 标准曲线

图3给出了以吸光度A为纵坐标，葡萄糖的浓度c为横坐标绘制的标准曲线。得回归方程A=11.85c-4.18×10-4，R2=0.997 (n=6)，表明在17～100μg/mL的质量浓度范围内葡萄糖的质量浓度与吸光度呈良好的线性关系。

图3 葡萄糖标准曲线

3.2.2 换算因子的测定结果

换算因素的计算公式为：

式中：W为试样多糖的质量；C为试样多糖中葡萄糖的质量浓度；D为供试液的稀释因素。

测得吸光度为0.341，计算得f=1.74。

3.2.3 玛咖多糖提取率的测定及其对提取条件的影响

将测得的吸光度带入回归方程中计算出玛咖干粉葡萄糖的质量分数，根据（2） 计算玛咖干粉中多糖的质量分数。

玛咖多糖质量分数

式中：C为供试液中葡萄糖质量浓度；D为供试液的稀释因素；f为换算因数；W为玛咖干粉的质量。

提取率按照（3）计算：

从图4中可知，随着提取温度的升高和提取时间的增加，玛咖多糖的提取率降低。如在70℃下提取1h，玛咖多糖的提取率为17.13%；提取2h的提取率为15.52%；提取3h的提取率为12.92%。在90℃下提取1h的提取率为12.42%；提取2h的提取率为11.93%；提取3h的提取率为11.01%。通过对比发现：在70℃下提取1h得到的玛咖多糖的提取率最高。

综合考虑提取温度和时间对玛咖多糖结构及提取率的影响，认为提取玛咖多糖的最佳条件为提取温度70℃，提取时间1h。

4 结语

图4 提取温度和时间对玛咖多糖提取率的影响

本文采用红外光谱法分析了提取温度和提取时间对玛咖多糖结构的影响。结果表明：提取温度相同时，提取时间1h～3h，得到的玛咖多糖的结构相似；提取时间相同时，提取温度在70℃～90℃，提取温度对玛咖多糖的结构无影响。采用紫外-可见吸收光谱法研究了提取温度和提取时间对玛咖多糖提取率的影响，得到提取玛咖多糖的最佳条件为温度70℃时提取1h。