基于16S rRNA测序技术初步探讨多囊卵巢综合征大鼠肠道菌群多样性

肖慧，刘艳霞，征征，邢雅雯，邢玉

多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome, PCOS)是女性最常见的一种生殖内分泌疾病[1]，可影响18%的育龄期女性[2]。PCOS以高雄激素血症(hyperandrogenism)、胰岛素抵抗(insulin resistance，IR)和持续无排卵为主要临床特征。引起近80%无排卵性不孕[3],且患子痫前期、妊娠糖尿病、流产等妊娠并发症及心理疾病、心血管疾病、子宫肿瘤等远期并发症的风险增加，严重威胁女性的身心健康[4]。PCOS发病机制尚不完全明确，近年来大量研究表明，肠道菌群在多种疾病的发生、发展中起到了重要的作用。最新研究表明，移植PCOS患者肠道菌群的小鼠表现出胰岛素抵抗、生育力下降、卵巢组织中小卵泡增多和黄体减少等现象，而移植正常人群肠道菌群的小鼠，并无上述表现，提示肠道菌群与PCOS密切相关[5]。而基于16S rRNA高通量基因测序技术，观察来曲唑联合高脂饮食诱导的PCOS大鼠肠道菌群多样性的特点，尚未见文献报道。

本研究复制来曲唑联合高脂饮食诱导的PCOS大鼠模型，以16S rRNA高通量基因测序技术，对PCOS大鼠肠道菌群多样性进行OTU分析、α多样性分析、Beta多样性分析、物种差异分析等，阐明PCOS肠道菌群的特点，为深入探讨PCOS的发病机制及中药的作用靶点提供基础，报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 (1)动物及分组： SPF级雌性SD大鼠12只[北京维通利华，生产许可证号:SCXK(京)20166-0006]，21日龄，体质量50～70 g，按随机数字表法分为对照组及模型组，每组6只。屏障环境喂养。高脂饲料配方：基础饲料加0.3%胆固醇、10%猪油(北京科澳协力饲料有限公司)，动物伦理审查批号(BUCM-4-2018101001-4030)。(2)实验药物：来曲唑(江苏恒瑞医药股份有限公司)。(3)仪器及试剂：离心机(恒诺仪器 AXTGL16M)、切片机(Leica RM2235)、石蜡包埋机(Leica G1150H)、 I-Sanger生信云平台(https://www.i-sanger.com/)，促黄体生成素(LH)测定试剂盒、促卵泡激素(FSH)测定试剂盒、血清雄激素(T)测定试剂盒、血清泌乳素(PRL)测定试剂盒、血清孕酮(P)测定试剂盒、血清雌激素(E2)测定试剂盒均购自北京北方生物技术研究所。

1.2 实验方法 2018年10月—2019年3月于北京中医药大学进行实验。PCOS大鼠模型的建立：来曲唑1 mg·kg-1·d-1溶于1%羧甲基纤维素(CMC)中，模型组大鼠连续灌服42 d，予高脂饲料喂养；对照组大鼠同期灌服等容积等浓度的基质CMC，予普通饲料喂养。大鼠雄激素水平升高且卵巢HE染色提示卵巢呈多卵泡样改变，表明PCOS大鼠造模成功。

1.3 观测指标与方法

1.3.1 血清学性激素指标水平检测： 大鼠最后一次给药后，禁食12 h，腹腔注射0.4%戊巴比妥1 ml/100 g,大鼠昏迷后，75%酒精消毒腹部皮肤，打开腹腔,腹主动脉取血4 ml， 离心取血清，以放射免疫法检测血清性激素6项：T、E2、FSH、LH、P、PRL水平。

1.3.2 卵巢形态学观察：选取大鼠右侧卵巢，4%多聚甲醛固定，卵巢组织HE染色，制作石蜡切片，光镜下观察卵巢组织学特点。

1.3.3 肠道菌群多样性检测： 基于16S rRNA测序技术检测[6]。(1)采集各组大鼠结肠粪便。(2)使用DNA 提取试剂盒提取每个粪便样本中总DNA。(3)以细菌16S rRNA 基因的V3～V4可变区序列为靶标，以带有barcode 序列的338F-806R为引物，进行PCR扩增，获取PCR产物。(4)PCR产物经过定量后，通过PCR将Illumina官方接头序列添加至目标区域外端，回收PCR产物，Tris-HCl缓冲液洗脱，2%琼脂糖电泳检测，氢氧化钠变性，产生单链DNA片段，构建MiSeq文库；利用 Illumina MiSeq PE300等平台进行高通量测序，获取细菌16S rRNA 基因的V3～V4 可变区碱基序列信息。(5) OTU分析，OTU是在系统发生学或群体遗传学研究中，为了便于进行分析，人为给某一个分类单元(品系，属，种，分组等)设置的统一标志。利用 QIIME 软件，对测序序列进行质控及 OTU聚类，获取 OTU 对应的分类单元(包括门、纲、目、科、属、种)及其相应的丰度信息。(6)α多样性分析，Shannon指数是描述一个特定区域或生态系统内多样性的度量指数，通过计算Shannon指数评估样品中细菌菌群的丰富度和均匀度。(7)主成分分析(principal component analysis，PCA)是一种对数据进行简化分析的技术，可以有效地找出数据中最“主要”的元素和结构，去除噪音和冗余，将原有的复杂数据降维，揭示隐藏在复杂数据背后的简单结构。(8)物种差异分析，应用LEfSe多级物种差异判别及组间差异比较，分析各组大鼠肠道微生物群落表现出的丰度差异。

2 结 果

2.1 2组血清性激素指标水平比较 模型组雄激素(T)水平高于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)，余指标比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

2.2 2组大鼠卵巢形态学比较 模型组卵巢可见多个不成熟小卵泡，小卵泡周围颗粒细胞层数较少，未见成熟卵泡及黄体；而对照组卵巢内可见少数成熟大卵泡，成熟卵泡颗粒细胞层较厚，内可见卵丘，卵巢内可见多个黄体，见图1。

2.3 肠道菌群多样性比较 每组各有1只大鼠标本不合格，故最终行16S rRNA高通量基因测序的样本为每组5只。

2.3.1 OTU分析及物种组成分析： 2组大鼠共有OTU数431个，模型组特有122个，对照组特有132个。根据OTU聚类的结果，可获得2组大鼠在门、纲、目、科、属、种及OTU水平的丰度信息，其中， PCOS模型组与对照组大鼠门、科、属水平群落Bar图见图2～4。

2.3.2 α多样性分析： 模型组和对照组的Shannon指数分别为2.767 5和3.083 5， 2组肠道菌群比较差异无统计学意义(P=0.268)。

2.3.3 PCA分析： 剔除远离总体的部分样本后，PCA结果表明，对照组和模型组肠道菌群组成有明显差异。PC1和PC2轴对结果的解释度分别为59.38%和21.15%，见图5。

2.3.4 物种差异分析

2.3.4.1 门水平菌群丰度比较 2组大鼠肠道门水平菌群丰度比较(前10位)， 菌群组成以厚壁杆菌门和拟杆菌门为主。对照组拟杆菌门占(41.26±3.60)%，厚壁杆菌门占(50.88±3.67)%；模型组拟杆菌门占(19.88±5.65)%，厚壁杆菌门占(66.48±3.93)%。与对照组比较，模型组拟杆菌门丰度显著降低(t=-2.951,P=0.033)，厚壁杆菌门丰度升高(t=2.800，P=0.038)，见图6。

2.3.4.2 拟杆菌门/厚壁杆菌门的比值 对照组为0.83±0.13，大于模型组的0.39±0.11。2组比较差异有统计学意义(t=-3.378，P=0.020)。

图2 2组大鼠门水平群落Bar图

表1 2组大鼠血清性激素水平比较

注：红色箭头所示为卵泡，黑色箭头所示为黄体。对照组卵巢内可见多个黄体和优势卵泡，优势卵泡颗粒细胞层数较多，且可见卵丘(对照组放大100倍红色箭头所示)；模型组卵巢内可见大量小卵泡，小卵泡周围颗粒细胞层数较少，仅可见少数黄体，未见优势卵泡

图1 2组大鼠卵巢组织形态学情况比较(HE染色)

图3 2组大鼠科水平群落Bar图

图4 2组大鼠属水平群落Bar图

2.3.4.3 属水平菌群丰度比较 与对照组比较，模型组Alloprevotella(属普氏菌科)、拟杆菌属(Bacteroides)、Ruminococcaceae_UCG-005(属瘤胃菌科)、Ruminiclostridium-6(属瘤胃菌科)、Prevotellaceae_NK3B31_group-6(属普氏菌科)、副拟杆菌属(Parabacteroides)、Bacteroides pectinophilus group(属梭菌目，毛螺菌科)丰度均显著减少，Romboutsia(属梭菌目，消化链球菌科)、Parasutterella(属变形菌门)和Lachnoclostridium(属梭菌目，毛螺菌科)丰度均显著增加，差异有统计学意义(P均<0.05)。前10位有丰度差异的属水平菌群见图7。

图5 2组大鼠PCA分析结果

2.3.4.4 LEfSe多级物种层级树图 LEfSe是一种用于发现高维生物标识和揭示基因组特征的软件，包括基因、代谢和分类。该软件使用非参数Kruskal-Wallis秩和验检，检测具有显著丰度差异特征，并找到与丰度有显著性差异的类群。红色和蓝色节点分别表示在模型组和对照组中显著富集，且组间差异存在显著影响的微生物类群；淡黄色节点表示在不同分组中均无显著差异，或组间差异无显著影响的微生物类群。与对照组比较，PCOS模型组大鼠肠道菌群中门、纲、目、科、属、种等各个水平的拟杆菌门的丰度均减少，包括属水平的Allpprevotella、拟杆菌属、副拟杆菌属、普氏菌属等，厚壁菌门中瘤胃菌科的多个属水平及种水平的菌群丰度减少。与对照组比较，模型组大鼠厚壁菌门梭菌目中的科、属、种水平的梭菌均增多；厚壁杆菌门中各个分类水平的丹毒丝菌均增多，消化链球菌科、属、种水平的Romboutsia均增多,毛螺菌科中多个种属水平的菌群丰度增多；放线菌门中目、科、属、种水平的红蝽菌均增多；变形菌门中，种和属水平的Parasutterella均增多。

3 讨 论

肠道菌群在人类健康中起着重要作用，被称为“成人的第二大脑”，肠道菌群基因又被看作“人类第二基因组”[7]。近年来大量研究表明，肠道菌群在多种疾病的发生、发展中起到了重要的作用，提出了通过干预肠道菌群以防治疾病新的临床策略。

为避免外界环境对肠道菌群的影响，肠道菌群多样性检测的标本为结肠中的粪便。多个临床研究表明[8-9]，与正常女性比较，PCOS患者肠道菌群α多样性降低。最新研究发现[10]，PCOS患者高雄激素血症与α多样性呈负相关。本研究对照组α多样性指数高于模型组，但差异无统计学意义，可能与样本量较少有关。

本实验结果表明，来曲唑联合高脂饮食诱导的PCOS大鼠模型存在肠道菌群失调的现象。Kelley等[11]用来曲唑诱导 PCOS 小鼠模型，结果发现来曲唑诱导的PCOS小鼠体内肠道菌群物种的多样性和丰度减少，主要表现为拟杆菌属(Bacteroides)丰度显著减少(所有OTU水平的拟杆菌丰度均减少)，而梭菌属丰度增多，这与本研究结果一致。也有研究采用Real-time PCR方法检测肠道菌群，结果表明，与对照组比较，来曲唑诱导的PCOS模型大鼠的乳酸菌、瘤胃球菌属、梭菌减少，而普氏菌增多[12]。与本研究结果不完全一致，可能与2项研究应用的检测方法、造模方法不尽相同有关。

Allpprevotella可以降解糖类，产生短链脂肪酸，研究表明[13-14]，其丰度与肥胖、糖尿病、心血管疾病和代谢综合征呈负相关。PCOS为代谢相关疾病，常合并肥胖、胰岛素抵抗等，结合本实验研究结果，PCOS大鼠肠道菌群中Allpprevotella丰度下降，因此Allpprevotella的丰度可作为改善肠道菌群，防治PCOS的潜在靶标之一。拟杆菌属作为一种常见益生菌，对宿主健康起着重要作用，如促进调节T细胞的分化，抑制炎性反应，影响宿主的免疫系统等[15]。副拟杆菌属是可以参与代谢调节的益生菌，研究表明，狄氏副拟杆菌(parabacteroides distasonis)可通过产生琥珀酸盐和次级胆汁酸缓解肥胖,降低血糖，缓解脂肪肝。普氏菌属是和高植物饮食相关的益生菌，大麦仁饮食调控血糖的作用可能与增加普氏菌丰度有关[16-17]。瘤胃菌作为一种短链脂肪酸的产生菌，可以降解多种多糖和纤维，其丰度与肠道通透性、酗酒、肝性脑病、非酒精性肝硬化均呈负相关[18]。研究表明，多种疾病与梭菌属有关，如假膜性结肠炎、婴儿型肉毒中毒、破伤风、急性水样腹泻、坏死性小肠结肠炎等。Parasutterella与慢性肠道炎性反应有关[19-20]。红蝽菌科是神经性厌食症患者肠道菌群中惟一丰度增加的菌群。高脂饮食可以增加丹毒丝菌的丰度[21-22]。结合本实验研究结果，PCOS大鼠拟杆菌属、副拟杆菌属、普氏菌属、瘤胃菌科等益生菌丰度减少，而梭菌属、Parasutterella、红蝽菌科等有害菌群丰度增加，丹毒丝菌的丰度增加可能与模型组大鼠高脂饮食相关。

图6 2组门水平菌群丰度比较

图7 2组属水平菌群丰度比较

肠道菌群可以通过产生活跃的信号分子影响宿主免疫、代谢及生殖功能。其中，脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是最重要的分子之一，又称内毒素，是肠道革兰阴性细菌的细胞壁组成成分，引发了炎性反应相关过程[23-25]。益生菌丰度减少，有害菌群丰度增加，导致肠道菌群紊乱，进而致肠黏膜受损，肠道通透性增加，LPS进入循环，激活细胞表面的Toll样受体4(toll-like receptor 4,TLR4)，进而介导多个炎性信号通路，包括激活核转录因子(nuclear transcription factor-κB，NF-κB)信号通路，诱导TNF-α、IL-18、IL-6等促炎因子的分泌[26-28]。而升高的TNF-α、IL-18、IL-6均可以通过调控胰岛素相关信号通路，引起胰岛素累积，增多的胰岛素进一步导致卵巢产生更多的雄激素，干扰正常卵泡的发育，从而加剧PCOS的发生。这可能是肠道菌群紊乱加剧PCOS的潜在机制之一。明确PCOS发病的潜在机制，可为其防治提供新的临床策略。

此外，调节肠道菌群是中药口服治疗疾病的机制之一，研究表明，中药可以增加益生菌的丰度,三萜类化合物如人参皂苷、甘草苷、桔梗皂苷等，黄酮类化合物如槲皮苷、黄芩苷等，环烯醚萜类化合物如当归苷、芍药苷等均可增加拟杆菌和双歧杆菌的丰度。黄连素可以提高小鼠肠道菌群中拟杆菌/厚壁杆菌的比值，增加拟杆菌丰度。灵芝可降低肥胖小鼠肠道菌群中厚壁杆菌/拟杆菌比值和变形杆菌的丰度[29-31]。PCOS是中医药的优势病种，此研究可为进一步探究PCOS的中医药防治提供新思路和研究基础。

综上，本实验创新性地探究来曲唑联合高脂饮食诱导的PCOS大鼠肠道菌群多样性的特点。研究结果表明，PCOS大鼠肠道菌群存在菌群失调的现象，拟杆菌门丰度减少，厚壁杆菌门丰度增加，拟杆菌门/厚壁杆菌门的比值降低，Allpprevotella、拟杆菌属、副拟杆菌属、普氏菌属、瘤胃菌科等益生菌丰度减少，而梭菌属、Parasutterella、红蝽菌科等有害菌群丰度增加。此为进一步探究PCOS的防治提供新思路。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

肖慧：实施研究过程，数据收集、分析，论文撰写；刘艳霞：提出研究方向，指导研究设计，指导论文写作，论文审核；征征：协助实验实施、数据收集；邢雅雯：协助数据分析；邢玉：提出研究思路和研究选题，设计研究方案、研究流程，设计论文框架，论文修订及审核