高效液相色谱法测定卡巴匹林钙产品与反应液中尿素的含量

王瑞菲，徐婷，魏凤，王艳，冯维春*

(1.青岛科技大学山东化工研究院，济南 250014；2.山东省化工研究院,山东省水相有机合成及高效清洁分离工程技术研究中心，济南 250014)

卡巴匹林钙，是“阿司匹林”(乙酰水杨酸)衍生物，是乙酰水杨酸钙与尿素的络合物，能够在水中分解为乙酰水杨酸进而发挥解热、阵痛、抗炎及抑制血小板聚集作用[1]，还可在畜牧养殖等领域中用于猪、鸡、牛等各种动物的发热和缓释疼痛[2-3]。尿素的含量作为卡巴匹林钙的一个重要检测指标，其测定结果决定了产品的质量，而且在卡巴匹林钙生产过程中，卡巴匹林钙与卡巴匹林钙反应液中尿素含量的测定，对于工艺和中控分析尤为重要，因此建立快速、准确的尿素含量测定方法具有重要的实际意义。卡巴匹林钙质量标准收载于2017年兽药质量标准目录中(农业部公告第1433号)[4]，主要采用紫外-可见分光光度法测定尿素的含量，但是在测定过程中，受衍生试剂(对二甲氨基苯甲醛)来源、衍生的温度等因素影响，该分析方法的重复性比较差。传统尿素测定方法主要有高效液相色谱-荧光法[5-7]、高效液相色谱-质谱法[8-9]、分光光度法[10-11]、折光率法[12]、比色法、脲酶法[13]等分析法，检测样品大多为白酒、环境、罐头食品等，存在检测成本高、操作繁琐、耗时长等弊端，不适用于卡巴匹林钙反应液中尿素含量测定。高效液相色谱法快速，应用广泛。高效液相色谱法直接测定卡巴匹林钙中尿素含量的方法未见报道。因此，本研究利用建立的方法进行实际样品检测，以期测定卡巴匹林钙以及卡巴匹林钙反应液中尿素的含量，为优化卡巴匹林钙的工艺路线提供技术支持以及完善卡巴匹林钙的质量控制提供参考数据。

1 仪器与材料

1.1 主要仪器 高效液相色谱仪：Thermo Ultimate 3000以及配套紫外检测器和工作站；SQP电子天平(感量0.1 mg)，德国赛多利斯天平公司；UV-2700紫外-可见分光光度仪，岛津公司。

1.2 材料 甲醇、乙腈为色谱纯，Thermo Fisher Scientific；其他试剂均为分析纯。尿素对照品，购于中国食品药品检定研究院，含量为100%，批号为100288-201302。

2 方法与结果

2.1 检测波长的选择 取尿素对照品适量，加水溶解并稀释成约含75 μg/mL溶液，在190～240 nm波长范围内进行扫描。综合考虑，本研究选择195 nm作为检测波长(图1)。

图1 尿素吸收波长光谱图

2.2 分析方法的选择 目前尿素的测定多采用乙腈-水体系作为流动相，由于尿素为强极性物质，在普通C18色谱柱上较难保留；在乙腈-水体系下，使用适用于强极性化合物测定的Waters Xselect HSS T3 C18色谱柱，卡巴匹林钙中尿素色谱峰与相邻色谱峰分离度<1.5，不符合色谱分离要求。选择甲醇-水作为流动相体系，能够增强尿素的保留能力。通过对不同甲醇-水比例与不同流速进行考察，选择甲醇-水最佳比例为5∶95(V/V)且流速为0.5 mL/min，尿素峰形对称，保留时间比较合适，分离较好。

2.3 高效液相色谱条件 色谱柱为Waters Xselect HSS T3 C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相为甲醇-水(5∶95，V/V)，检测波长为195 nm，流速为0.5 mL/min，进样量为10 μL，柱温为30 ℃。

2.4 尿素对照品溶液的制备 精密称取尿素对照品80 mg，用流动相溶解并稀释至100 mL，配制成0.8 mg/mL尿素标准储备溶液。精密量取10 mL，加流动相稀释至100 mL， 配制成0.08 mg/mL的尿素对照品溶液。

2.5 样品溶液的制备 精密称取卡巴匹林钙0.5 g，加流动相溶解并稀释至100 mL；精密量取10 mL，加流动相稀释至刻度100 mL，配制成卡巴匹林钙供试品溶液。

精密称取卡巴匹林钙反应液0.5 g，加流动相溶解并稀释至100 mL，配制成卡巴匹林钙反应液供试品溶液。

2.6 专属性试验 分别量取空白溶剂(流动相)、尿素对照品溶液、卡巴匹林钙供试品溶液和卡巴匹林钙反应液供试品溶液各10 μL，按照2.3项确定的色谱条件进行测定，试验结果见图2。尿素色谱峰的保留时间均约为5.59 min，尿素色谱峰与相邻色谱峰的分离度均大于1.5，达到基线分离，尿素的理论塔板数大于3000，表明其他组分对尿素测定无干扰。

(1为空白溶剂-流动相；2为尿素对照品溶液；3为卡巴匹林钙供试品溶液；4为卡巴匹林钙反应液供试品溶液)

2.7 灵敏度考察 取0.8 mg/mL尿素标准储备液，用流动相稀释，平行制备5份0.1 μg/mL尿素对照品溶液，供HPLC检测，取信噪比S/N≥3时的样品浓度为检出限(LOD)，信噪比S/N≥10的样品浓度为定量限(LOQ)。

添加浓度为0.1μg/mL时，信噪比S/N均大于10，信噪比满足定量限的要求，确定本方法的定量限。添加浓度为0.05 μg/mL时，信噪比S/N均大于3，信噪比满足检出限的要求，确定为本方法的检出限。

2.8 标准曲线及线性关系考察 分别量取0.8 mg/mL尿素标准储备液适量，加流动相稀释，配制成含尿素浓度约为0.12、16、32、48、64、80、96、120 μg/mL的标准溶液。依照浓度由小到大的顺序，按照上述确定的色谱条件，以质量浓度C为横坐标，相应的峰面积(A)为纵坐标，绘制标准曲线。尿素标准曲线为Y=3823X-286.7，相关系数r为0.99985(图3)。

图3 尿素的标准曲线

2.9 仪器精密度考察 取尿素对照品溶液(80 μg/mL)，按上述色谱条件重复连续进样6次，测得峰面积相对标准偏差为0.4%。表明此方法的仪器精密度良好(表1)。

表1 仪器精密度试验数据

2.10 重复性考察 取卡巴匹林钙(20181121批)与卡巴匹林钙反应液(20181121批)，分别平行制备6份卡巴匹林钙供试品溶液与卡巴匹林钙反应液供试品溶液，按上述色谱条件测定尿素含量，并计算相对标准偏差(表2～表3)。结果显示，卡巴匹林钙重复性的RSD为0.70%，卡巴匹林钙反应液重复性的RSD为0.92%，表明此方法的重复性符合要求。

表2 卡巴匹林钙中尿素重复性试验数据

表3 卡巴匹林钙反应液中尿素重复性试验数据

2.11 准确度考察

2.11.1 卡巴匹林钙准确度考察 取卡巴匹林钙(20181121批，尿素含量为重复性数据)0.25 g，分别加入尿素对照品适量，加流动相溶解，配制含尿素对照品浓度为24、32、40、48 μg/mL的供试品溶液。每个浓度水平制备5份平行供试品溶液，分别测定回收率、每个水平浓度下(组内)的RSD和所有浓度下的RSD。结果显示，卡巴匹林钙中尿素回收率范围为98.10%～100.46%，组内RSD范围为0.71%～0.93%，平均回收率为99.20%，RSD为0.75%(表4)。

2.11.2 卡巴匹林钙反应液准确度考察 取卡巴匹林钙反应液(20181121批，尿素含量为重复性数据)0.25 g，分别加入0.8 mg/mL尿素标准品储备液适量，配制含尿素对照品浓度为4、20、40、64 μg/mL的供试品溶液。每个浓度水平制备5份平行供试品溶液，分别测定回收率、每个水平浓度下(组内)的RSD和所有浓度下的RSD。结果显示，卡巴匹林钙反应液中尿素回收率范围为95.32%～101.20%，组内RSD范围为0.97%～1.97%，平均回收率为98.75%，RSD为1.44%(表5)。

表4 卡巴匹林钙中尿素回收率试验数据

表5 卡巴匹林钙反应液中尿素回收率试验数据

2.12 稳定性考察 取20181201批卡巴匹林钙与卡巴匹林钙反应液供试品溶液，分别于0、2、4、6、12、16、24 h进行测定，测得卡巴匹林钙中尿素峰面积相对标准偏差为1.2%，卡巴匹林钙反应液中尿素峰面积相对标准偏差为1.3%，表明供试品溶液稳定性良好。

2.13 实际样品测定 对实验室尿素规格13.10%的三批卡巴匹林钙样品分别采用本研究建立的检测方法和紫外-可见分光光度法进行检测，结果对比如表6所示。

表6 HPLC法与紫外可见分光光度法测定尿素含量结果比较(n=3)

通过上表数据对比发现，紫外-可见分光光度法测定的结果与本研究的高效液相色谱法相比，偏低且精度较差。

3 讨论与结论

《兽药质量标准汇编》(2017年)中尿素测定方法中衍生试剂为对二甲氨基苯甲醛，其来源不同造成的品质差异、存储过程中易变质等问题而且衍生温度与衍生放置时间等因素易引起数据波动，均可能对尿素分析方法的重现性和数据的精密度造成影响。另一方面，由于卡巴匹林钙反应液中尿素浓度范围广，《兽药质量标准汇编》(2017年)中尿素测定方法并不适用。

卡巴匹林反应液供试品溶液中成分复杂，且甲醇能够加强其他有机组分的洗脱，使尿素与相邻色谱峰分离达到色谱要求，提高分析方法的重复性。同时，流动相中含有的适量有机溶剂能够延长色谱柱使用寿命。相比于文献[5,14]中记载的尿素分析方法，本方法采用甲醇-水(5∶95，V/V)为流动相。与文献[6-7]所采用的荧光检测器与衍生测定尿素方法不同，采用紫外检测器进行尿素含量的测定，操作简单、灵敏度高、线性范围宽，适合卡巴匹林钙反应液中的尿素检测。

本研究建立了一种用于检测卡巴匹林钙产品及反应液中尿素含量的高效液相色谱方法；分离度R≥1.5；线性相关系数达到了0.999以上；重复性的标准偏差均小于1.0%；卡巴匹林钙产品中尿素的回收率范围为98.10%～100.46%，反应液中尿素的回收率范围为95.32%～101.20%；检出限为0.05 μg/mL。本方法具有分析时间短、灵敏度高、精确度好等优点，填补了国内空白；检测卡巴匹林钙产品与反应液中尿素含量，对产品生产工艺、中控分析及推广应用均具有重要的指导意义。