抗癌防移片对BALB/c小鼠大肠癌肝转移HGF、VEGF蛋白表达的影响*

★ 郭忠聪 龚纯 文枝 何飘 王理槐*（.湖南中医药大学第一附属医院 长沙 40007；.湖南中医药大学研究生院 长沙 40007）

关键字：抗癌防移片；大肠癌肝转移；血管新生；肝细胞生长因子（HGF）；血管内皮生长因子（VEGF）

大肠癌是最常见的消化道肿瘤之一，影响大肠癌患者预后的最大问题就是复发和转移［1］。在我国，随着社会经济的发展，居民生活习惯、 饮食结构变化以及人口结构年龄老龄化， 我国的大肠癌发病率和死亡率持续上升［2］。而我国大肠癌诊断时Ⅰ期的比例仅占5%， 超过60%的大肠癌患者确诊时已经处于中晚期。因此，我国现在面临大肠癌发病迅速上升但早期诊断比例低的严峻形势。目前手术是治疗大肠癌的主要方法，但大肠癌术后的复发率很高，约40%～70%的大肠癌患者于5年内死于转移和复发［3］。肝脏是大肠癌转移最好发部位，25%的患者发现癌肿时已有肝转移，另外25%在2年内出现肝转移，如此高的肝转移率说明肝脏可提供有助于转移瘤细胞建群和发展的环境条件［4］。目前西医临床上预防大肠癌术后转移主要采用化疗和放疗为主，但化、放疗影响机体的免疫功能，致肿瘤患者的免疫低下状态恶化，且部分患者因不能耐受化、放疗的毒副作用而导致治疗的终止而影响疗效［5］。中医药独特的对免疫功能调节作用和其毒副反应少的特性正好弥补了西医化、放疗的不足，具有广阔的应用前景［6］。本次研究是在建立小鼠大肠癌模型基础上，通过不同处理方式，观察各组大肠组织标本中HGF、VEGF蛋白表达，探讨HGF与VEGF两者之间是否存在直接关联性；抗癌防移片（ACMS）是否通过影响HGF、VEGF蛋白的表达降低大肠癌肝转移的发生。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 BALB/c小鼠共48只。雌雄各半，体重 20～25g，6～8 周龄。

1.1.2 药物组成 抗癌防移片（ACMS）系三湘名医经验方（由红参、半枝莲、黄芪、薏苡仁、姜黄、女贞子、墨旱莲、莪术、九香虫、枸杞子、白术、湘曲组成，湖南中医药大学附属第一医院药剂科生产，批号040106）。阳性对照药使用奥沙利铂（L-OHP）；5-氟尿嘧啶；亚叶酸钙（CF）。

1.1.3 主要试剂 小鼠HGF、VEGF试剂盒；免疫组化染色试剂盒；HGF、VEGF多克隆抗体；SABC试剂盒；DAB显色剂试剂盒等。

1.2 实验方法

1.2.1 造模方法 腹腔注射1%戊巴比妥钠（40mg/kg）麻醉BALB/c鼠，于背侧中部、左侧腋中线与腋后线间，取1.5cm左右切口进腹，显露脾脏，于脾脏上极沿脾脏纵轴进针，边退边注入CT26细胞悬液（1×10个/mL），后用蘸有络合碘的消毒棉签轻一压针眼处数秒，查看无出血后，将脾脏放回原位，全层缝合腹壁。

1.2.2 实验分组 实验分组将造模后的BALB/c小鼠按随机分为4组，每组12只：模型组，西药组，中药组，中西药组。模型组小鼠以生理盐水0.5mL灌胃，1次/d；西药组小鼠以（L-OHP+5-FU+CF）治 疗，L-OHP 1mg、5-Fu 4mg、CF 0.4mg，腹 腔注射，1次/周；中药组小鼠分别以ACMS混悬液0.5mL灌胃，各相当于60kg成人用量的5倍；中西药组小鼠以（ACMS+L-OHP+5-FU+CF）治疗：抗癌防移片0.1mL灌胃，1次/d、L-OHP 1mg，5-Fu 4mg，CF 0.4mg，腹腔注射，1次/周。实验各组于移植后第7d开始给药，共治疗4周。

1.2.3 观察指标及方法 免疫组织化学测定HGF、VEGF蛋白表达光镜下观察，阳性染色细胞胞浆或胞膜出现黄色或棕黄色颗粒。采用IPP6.0医学图像分析系统，每个组每个时间点分别选取5张切片，每张切片随机选取5个视野，测定阳性着色累积光密度（IOD）值，对HGF进行图像分析。

1.3 统计学处理 所有数据均输入SPSS21.0统计软件进行统计分析。计量资料用均数（x）±标准差（s）表示。组内不同时间点的均数比较采用单因素方差（ANOVA）分析。同一时间点的组间的均数比较采用t检验。P＜0.05时认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HGF和VEGF蛋白表达 在大肠癌表达的相关性见表1，HGF的表达和VEGF的表达显著相关（P＜0.05）。蛋白表达阳性判定是观察在细胞核或胞浆中出现棕黄色颗粒。结果判定采用的是半定量计分法。①选染色均匀的阳性表达区域，以着色细胞占视野细胞总数的多少计分：0分：≤5%；1分：6%～25%；2分：26% ～50%；3分：51%～75%；4分：＞75%。②显色度计分：高倍镜（×400）下取表达最强的部位，按显色程度计分，显色与背景相似者为0分；显色浅，略高于背景为1分；中度显色，明显高于背景为2分；强染，显色深棕色为3分。③总积分将上述两种积分乘积为0表示阴性（-），＞1分为阳性，其中1-2分表示弱阳性（+），3-4分表示阳性（++），≥5分表示强阳性（+++）。

表1 HGF和VEGF在48例BALB／c小鼠大肠组织表达情况

2.2 48例造模成功的大肠癌小鼠模型，在经过不同处理方式后，出现肝转移的例数与HGF、VEGF相关性见表2，经数据分析后两者之间呈正相关性（P＜0.05）。

表2 HGF和VEGF与出现肝转移例数

2.3 HGF、VEGF蛋白表达的检测 不同组别HGF、VEGF蛋白表达比较如图1所示。BALB/c小鼠大肠组织中HGF、VEGF蛋白电泳带的灰度值比较见表3。HGF与VEGF数据相比，两者呈正相关。四组数据P＞0.05，满足方差齐性检验。模型组HGF、VEGF蛋白电泳无明显变化，中西结合组与西药组HGF、VEGF蛋白电泳表达明显下降（**P＜0.01）。

图1 各组BALB／c小鼠大肠组织中HGF、VEGF蛋白Western Blot电泳条带

表3 各组小鼠大肠组织中HGF、VEGF蛋白表达比较（±s，n=12）

表3 各组小鼠大肠组织中HGF、VEGF蛋白表达比较（±s，n=12）

注：模型组与中西结合组相比，ΔP＜0.01，中西结合组与西药组相比，*P＞0.05。

分组 HGF蛋白表达 VEGF蛋白表达中西结合组 0.043±0.067Δ* 0.036±0.051Δ*西药组 0.281±0.039* 0.315±0.014*中药组 0.462±0.257 0.432±0.086模型组 0.714±0.210Δ 0.809±0.137Δ

3 讨论

中医学虽无“大肠癌”这一名称，但古代医学典籍中有众多的描述，如《灵枢·水胀》中其肠覃症状的描述颇似结肠癌腹内结块的表现，“肠覃何如？岐伯曰：寒气客于肠外，与卫气相搏……肉乃生。其始也，大如鸡卵，稍以益大，至其成也，如怀子之状，久者离岁，按之则坚，推之则移。”明代《外科正宗·脏毒》中描述的病症与大肠癌的病因、主要症状基本符合，并明确指出预后不良，“蕴毒结于脏腑，火热流注肛门，结而为肿，其患痛连小腹，肛门坠重，二便乖违，或泻或秘，肛门内蚀，串烂经络，污水流通大孔，无奈饮食不餐，作渴之甚，凡此未得见其生。”清代《外科大成·沦痔漏》说道锁肛痔与直肠癌症状特征基本符合，“锁肛痔，肛门内外犹如竹节锁紧，形如海蜇，里急后重，便粪细而带扁，时流臭水，此无治法。”故可从中总结，大肠癌应属中医学的“肠积”“积聚”“症瘕”“肠覃”“肠风”“脏毒”“下痢”“锁肛痔”等病的范畴［7］。对于大肠癌病因病机，认为肿瘤的发生是由于正气不足，脏腑功能失调，气滞、血瘀、痰凝、毒聚而形成，表现为局部属实，全身属虚的病症［8］。随着病情进一步发展，痰瘀毒结愈盛，加之治疗时攻伐太过，正气亏虚日甚，促进肿瘤的复发和转移。全身正气亏损乃肿瘤转移之根本，局部气血瘀滞、痰毒瘀结是肿瘤转移的关键［9］。

抗癌防移片系三湘名医经验方，由红参、半枝莲、黄芪、薏苡仁、姜黄、女贞子、墨旱莲、莪术、九香虫、枸杞子、白术、湘曲组成。方中以红参为君，有大补元气，复脉固脱，益气摄血的作用，以复身体之正气，抗肿瘤顽固之邪气，黄芪补气固表，白术、薏苡仁益气健脾，湘曲消食健胃，脾胃为气血生化之源，助红参补气之功；女贞子滋补肝肾，墨旱莲补肾益精，枸杞子滋补肝肾，肝肾得补，气血调和，阴阳互生。脏腑功能协调，气血充足以抗肿瘤之邪。半枝莲味辛、苦，性寒，清热解毒，化瘀利尿，以祛肿瘤顽固之瘀毒；莪术行气破血，以消肿瘤症瘕积聚之结块，九香虫、姜黄行气破血，加强莪术消症瘕之功。全方合用，共奏益气扶正，化瘀解毒之功。前期临床应用观察表明，抗癌防移片对乳腺癌术后转移有抑制作用，在我们的长期临床应用也发现，抗癌防移片对大肠癌术后肝转移也有类似的预防作用。

肿瘤的生长和转移是一个依赖血管生成的过程，近年的研究证明促血管内皮生长因子与肿瘤的转移密相关［10］。肝细胞生长因子（HGF）具有显著地促细胞有丝分裂、细胞运动；促血管内皮细胞增生和新血管生成；抑制细胞凋亡，促血管内皮细胞再修复，抗纤维化等多种生物学作用［11］。血管内皮生长因子（VEGF）具有促血管内皮细胞增殖作用，对于诱导血管内皮细胞有丝分裂具有高度特异性，能够刺激内皮细胞增殖，并促进血管形成，为肿瘤细胞生长发育提供营养，为肿瘤新生血管网的建立提供保障，并为肿瘤细胞的远处转移提供管道［12］。在本次研究实验中发现，第一：HGF与VEGF的表达呈正相关性，且两个蛋白的表达与肝转移的发生发展也成正相关性，但HGF是否通过何种机制调控大肠癌组织中VEGF表达尚需要进一步研究。第二：经抗癌防移片和西药一起联合干预的实验组别，HGF、VEGF蛋白表达量最低，与模型组比较，HGF、VEGF蛋白表达明显升高（P＜0.01）；与中药组比较，HGF、VEGF蛋白表达明显升高（P＜0.05）；中西结合组与西药组比较，HGF、VEGF蛋白表达下降（P＞0.05）。从本次实验研究结果分析可得出，抗癌防移片预防肝转移的机制可能与抑制HGF、VEGF蛋白表达有关。