NIRS结合一致性检验及相关系数法快速鉴别药用菊花和其他菊花*

★ 刘家水 谈永进* 毛小明 陈向阳 马逢时（安庆医药高等专科学校药学系 安徽 安庆 246052）

菊花来源于菊科菊Chrysanthemum morifoliumRamat.的头状花序，2015版中国药典中收载有杭菊、贡菊、亳菊、滁菊、怀菊五种药用菊花，具有散风清热，平肝明目，清热解毒之功［1］。目前中药材市场和花茶市场菊花品种繁多，主要有药用菊花和大马牙、金丝皇菊、野菊Ghrysanthemum indicumL.、洋甘菊Matricaria recutitaL.、金盏菊Calendula of ficinalisL.及雪菊Coreopsis tinctoriaNutt.等其他茶饮菊花，质量参差不齐。前人有关菊花品质的鉴别研究主要集中在性状、电子鼻、薄层色谱、远红外等方法及菊花含硫量检测方面［2-4］，近年来NIRS在中药品种、真伪定性鉴别研究方面，相对传统方法具有可以车载现场检测、检测结果报告快速、准确、人为影响因素小等优势，已有学者进行研究报道［5-8］，其中张丹雁等报道了近红外光谱快速鉴别南板蓝根真伪优劣，两种模型在专属性考察时难以将南板蓝根和南板蓝地上茎区分，结合成分分析建议扩大南板蓝药用部位。本文收集不同产地、不同品种的药用菊花和其他茶饮菊花作为研究对象，拟采用OPUS近红外光谱分析软件定性鉴别模块中车载近红外光谱仪普遍应用于西药快速定性鉴别的一致性检验方法对两者进行鉴别研究，同时采用相关系数法进一步验证一致性检验法的内部量化关系和准确性，探讨两种方法应用于不同产地、不同品种和形态及化学组分相似的药用菊花和其他茶饮菊花鉴别的可行性，为进一步完善和充实菊花鉴别方法提供参考，思考NIRS应用于化学成分含量相似的复杂体系样品鉴别时的局限性与面临的困惑。

1 材料

1.1 仪器 傅立叶变换近红外光谱仪（Matrix-F，德国布鲁克公司），光谱软件（OPUS，德国布鲁克公司），手持光纤探头，铟镓砷检测器，超高速多功能粉碎机（LYSF-500-Y，长沙市卓成医疗器械有限公司），药典标准筛（60目）。

1.2 药品 5种不同产地、不同品种和形态及化学组分相似的药用菊花样品杭菊、贡菊、亳菊、滁菊、怀菊分别采自浙江桐乡、安徽歙县、安徽亳州、安徽滁州、河南焦作等道地产区，大马牙采自安徽亳州谯城区，金丝皇菊采自安徽东至县，野菊采自安徽贵池区，洋甘菊、金盏菊、雪菊收集于安徽亳州中药材市场，以上样品经安庆医药高等专科学校谈永进教授鉴定为菊科杭菊、贡菊、亳菊、滁菊、怀菊、大马牙（亳菊栽培品种）、金丝皇菊、野菊、洋甘菊、金盏菊及雪菊的头状花序。样品信息见表1。

表1 药用菊花和其他菊花样品信息

2 方法与结果

2.1 光谱采集方法 取干燥同条件密闭储存的药用菊花和其他菊花样品，粉粹过60目标准筛，取适量粉末置入光谱采集管中，用光纤探头匀力压平粉末，对准光谱采集管底部扫描，得到样品的全波长近红外光谱，重复扫描3次，分析时用平均光谱。扫描时间32s，分辨率8cm-1，温度18～25℃，扫描次数64［7-8］。以上光谱采集方法与文献报道和目前食品药品监督部门应用一致性检验法测定西药的光谱采集方法基本一致［7-10］。

2.2 光谱预处理方法和波长范围的选择 近红外光谱由含氢的一级、二级倍频和合频吸收区域组成，光谱重叠现象严重，区分度不高，分析前采用合适的化学计量学方法进行光谱预处理，以降低或消除来自高频噪音、基线漂移与光散射等因素产生的光谱误差［7-8］。本实验通过光谱分析软件考察矢量归一化、导数化及导数化+矢量归一化等光谱预处理方法，其中矢量归一化可以消除光程或样品厚度带来的影响，导数化可以消除基线漂移等因素影响，导数化+矢量归一化预处理可降低或消除各类因素对光谱的干扰，进一步接近真实光谱［7-8］。合频区波长范围为4 000～5 000cm-1，一级倍频区波长范围为5 000～9 000cm-1，二级倍频区波长范围为9 000～12 000cm-1，二级倍频区噪音大，基线漂移严重，5 168cm-1是水分对光谱影响敏感区，一般二级倍频区和水份敏感区不作分析区域［7-8］，本实验在合频和一级倍频信息量丰富区内分析光谱数据，光谱波长范围的选择采用交互式选择方式。以上光谱预处理方法和波长范围的选择方法与文献报道中方法基本一致［7-8］。

2.3 光谱鉴别模型的建立方法 本实验采用一致性检验建立不同产地、不同品种和形态及化学组分相似的药用菊花和其他菊花鉴别模型，相关系数法进一步验证一致性检验方法的量化关系和准确性。一致性检验是一种快捷的图谱比较方法，用于比较待测光谱与参考光谱是否具有一致性，是使用正品样品参考光谱为每个波长点设定容许范围，检验待测样品光谱的每个吸光度值是否在容许范围内，待测样品光谱在每个波长点均有一个CI值，各波长点CI值连接成一张完整的CI光谱，待测样品与参考光谱具有一致性要求CI光谱的每个CI值均不超过CI限度值［7-8］。相关系数法是指在特定波长范围内将待测光谱与参考光谱或样品集平均光谱进行比较，计算待测光谱与参考光谱相似度高低［7-8］。

2.4 药用菊花和其他菊花近红外光谱图 不同产地、不同品种和形态相似的药用菊花和其他菊花的化学组分相似，化学成分含量稍不同，在近红外光谱中相似的成分组成掩盖了成分含量的差异，直观上观察难以区别各光谱差异。图1中药用菊花和其他菊花的近红外光谱形态非常相似，很难从光谱图直接进行判断，仅雪菊的化学组分和含量与其他菊花差异较大［11］，可以从谱图上看出与其他光谱差异稍大，但仍难以数据或更直观的形式显示。本文采用NIRS结合一致性检验和相关系数法采用合适化学计量学方法提取光谱中特征信息，找出复杂光谱中所掩盖的特性信息用于光谱分析。

图1 药用菊花和其他菊花的近红外光谱

2.5 一致性检验方法的建立与验证

2.5.1 样品集与检验集的选择 依据样品鉴定结果，本实验选取152个药用菊花光谱作为样品集，63个其他菊花光谱作为检验集。

2.5.2 一致性检验模型的建立 通过对预处理方法和波长范围的筛选，优选光谱最佳预处理方法为一阶导数+矢量归一化法，交互式筛选最佳波长范围 为 8 956.0～7 216.5cm-1、6 587.8～5 361.3cm-1、4 948.6～4 038.3cm-1，17点平滑建立模型。建模时金丝皇菊2个样品出现异常值，在CI=3.0限度值以下，不能区分开，经查文献和与老药农交流显示金丝皇菊为黄贡菊的选育品种，与贡菊亲缘关系较近，可能金丝皇菊与贡菊的化学组分和含量极为相似，在建模时应剔除［12］。在已建立的模型中，当CI限度值为3时，可以看到菊花和其他菊花之间存在明显差异，图2中CI=3限度值下为样品集，CI=3限度值上为检验集，表明除金丝皇菊外药用菊花和其他菊花可较好区分开。其中雪菊CI值在22.3～26.3之间，金盏菊的CI值在9.3～10.3之间，其他检验集样品CI值在3.3～7.3之间，而目前西药一致性检验模型的CI限度值一般设置为5及以上，本实验中在CI值为5时难以区分样品集和检验集。从图3CI谱图可看出样品集光谱与检验集光谱的整体的情况，在CI=3限度值下是有重叠部分，CI=3限度值以上只能看到检验集CI光谱。

图2 药用菊花和其他菊花的一致性检验模型与CI限度值

图3 药用菊花和其他菊花的CI谱图

2.5.3 一致性检验模型的验证 专属性验证：本实验选取5份药用菊花光谱和除金丝皇菊外5份其他菊花光谱为测试光谱，结果5份药用菊花光谱均在CI=3限度值以下，5份其他菊花光谱均在CI=3限度值以上，表明除金丝皇菊外模型专属性较强。

耐用性验证：本实验考察了不同光谱采集者、不同光谱采集时间等情况下模型的耐用性，结果均达到理想结果，表明模型耐用性较好。

2.6 相关系数方法的建立与验证

2.6.1 样品集与检验集的选择 与一致性检验建模相比，相关系数法不需过多样品光谱生成阈值，建模时可选择单一光谱或多张光谱的平均光谱作为参考光谱［7-8］。本实验中考虑到菊花成分复杂，单张光谱不能代表所有样品信息，为增加模型的准确性和可靠性，选定100张药用菊花光谱作为样品集，选定52张药用菊花和63张其他菊花光谱为检验集。

2.6.2 相关系数模型的建立与验证 通过预处理方法和波长范围的筛选，选取最佳光谱预处理方法为二阶导数化，交互式筛选的波长范围为6 200～5 500cm-1、5 000～4 700cm-1，17点平滑建立相关系数模型，模型阈值设置为97%、98%和99%，统计检验集与样品集超过阈值的样品数。结果见表2～3，表2中阈值97%、98%和99%时，52批药用菊花与样品集相似度均通过验证，表3中阈值为0.99时仅2个金丝皇菊样品出现异常，这与建立一致性检验模型时相同，可能金丝皇菊与贡菊的化学组分和含量极为相似有关，表4列举了5份药用菊花和6份其他菊花与样品集的相关系数，金丝皇菊与模型相关系数为0.9925，超过0.99阈值，建模时需剔除。通过表2～4可知宜将相关系数的阈值设定为0.99，此时可将药用菊花和其他菊花区分，提高相关系数模型的可行性和准确性。

表2 52张检验集药用菊花光谱与样品集间的相关系数统计结果

表3 63批检验集其他菊花与样品集间的相关系数统计结果

表4 5份药用菊花和6份其他菊花与样品集的相关系数

2.7 两种方法的实验结果分析及各自的优缺点 本实验中采取一致性检验方法鉴别不同产地、不同品种和形态及化学组分相似的药用菊花和其他菊花，建模时都出现异常值，异常值为金丝皇菊。除金丝皇菊外模型的专属性和耐用性良好，相关系数法进一步验证了一致性检验模型的实验结果，并给出了相关光谱间的量化值。实验结果与一致性检验方法基本一致，均存在异常值，表明一致性检验和相关系数法鉴别药用菊花和其他菊花存在继续研究和思考的地方。说明目前NIRS和化学计量学方法在鉴定化学组分含量类似情况下还不能做到像液相色谱、生物技术鉴别结果那样准确一致。但对于组分或含量差异大的样品，NIRS结合一致性检验和相关系数法还是表现出快速、准确的优势。

通过本次实验，可知一致性检验方法能够一次检验多个待测样品，鉴别快速，从CI谱图可直观看出样品是否在样品集内。但也存在几个方面缺点：①建模时需要的样品集数量要求要多，一般至少30批以上，尤其是像复杂体系样品药用菊花，存在品种多，栽培类型多，产地多，栽培环境差异等诸多对化学成分含量有影响的样品，建模时样品集一定要包含所有可能体现样品信息的样品，建模前期准备工作量大；③对于化学组分和成分含量极为相似的样品在检验时容易出现假阳性等，要注意区分，今后仍要加强光谱采集、光谱信息提取分析等方面研究力度。相关系数法能够较快速、直观的给出待测光谱与样品集的相似度数据，建模时不需要过多光谱作为样品集。但也存在以下几个方面缺点：①相关系数法每次只能检测一个样品；②样品集采取的是样品平均光谱，可能不能全面体现样品集信息等；③不同波长范围内相似度可能不一样，在宽谱段条件下计算相关系数，会忽略检验光谱与参考光谱之间的小谱峰差异等。在实际鉴别工作，NIRS应用于复杂体系鉴别时，不能完全借鉴西药鉴别经验，要结合实际，根据工作需要选择最佳的鉴别方法。

3 讨论

NIRS结合一致性检验法和相关系数法两种方法均具有建模简单、快速等优点，目前在国内外西药及中成药快速分析中得到应用［9-10］。一致性检验法只要样品集足够大，一般不会出现假阳性，相关系数法对样品数量要求不高。目前食品药品监督部门已推广车载近红外光谱结合一致性检验法和相关系数法应用，对打击伪劣药品具有重要意义，而且建立的模型可以在食药监体系内共享，实现了数据间的传递、维护及更新等。该方法之所以能够推广应用与检测对象西药和部分中成药的化学组分和成分含量差异大有极大关系，而对于化学组分和成分含量差异相似的复杂体系存在一定的假阳性率，本实验中金丝皇菊出现了假阳性，建模时应剔除。复杂体系样品近红外光谱反映的是成分的综合信息，如中药的品种、产地、加工炮制等因素均会影响光谱信息，在样品处理过程中，要保持样品的一致性，才能确保模型的准确性。本实验中NIRS结合一致性检验和相关系数法鉴别药用菊花和其他菊花，具有一定的实用性和借鉴意义。今后仍需在复杂体系样品的样品处理、光谱采集、光谱信息提取及化学计量学等领域深入研究，提高光谱信息提取的精确性，模型的可靠性，以期更准确鉴别复杂体系样品及在相关药品生产、在线监测等领域的推广应用。