吉林汉族人群糖尿病与维生素D受体基因的相关性

王海英 孙亚东 金涛 武杨 谢立凯 张兵 李柯旻 马彦 姜艳静

(吉林省人民医院，吉林 长春 130000)

糖尿病(DM)发病机制复杂，尚未完全阐明，近年来大量研究证实，遗传易感性对胰岛素抵抗、胰岛素分泌的发生、发展起着重要作用，通过对2型DM(T2DM)遗传方式的研究，发现可能有多个基因参与T2DM的发生〔1～3〕。作为一系列代谢产物总称的维生素D，其活性形式是1，25-双羟维生素D，近年来研究表明，维生素D除经典的调节钙磷代谢对骨骼发育的影响外，还能调节体内的炎症状态，增强机体的屏障功能，对胰岛细胞具有保护作用〔4〕。而维生素D必须与维生素D受体(VDR)结合后才能进一步发挥其生理作用，目前国内外不同地区关于VDR多态性与T2DM关系的观点尚不一致，本研究旨在探讨吉林地区T2DM患者VDR Bsm1位点基因多态性的变化研究。

1 对象与方法

1.1研究对象 选择2017年1～6月在吉林省人民医院内分泌科门诊及住院的T2DM患者150例，按1999年WHO DM标准诊断：空腹血糖(FPG)≥7.0 mmol/L，餐后2 h血糖(2 hPG)≥11.1 mmol/L，除外肾功能损害及长期服用影响骨代谢药物者，同期收集吉林省人民医院院体检中心健康体检者100例，记录姓名，性别，年龄，体重，身高，血压。所有研究对象为吉林地区的汉族人群，无血缘关系，女性患者排除妊娠，对实验目的知情同意。

1.2一般资料 完善本研究入组者的姓名、性别、年龄、糖尿病病程、身高、体重、血压等一般资料。

1.3实验室指标 受试者禁食8～10 h后，晨起抽取空腹肘正中静脉血，测定FPG、2 hPG、总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、糖化血红蛋白(HbA1c)，生化指标用奥林巴斯AU5400全自动生化分析仪测定，HbA1c使用高效液相色谱法测定。收集每位入选者外周静脉血4 ml，采用酚-氯仿法提取基因组DNA。通过聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)检测T2DM患者VDR Bsm1基因多态性。参照有关文献设计上下游引物，上游引物：5′-CAACCAAGACTACAAGTACCGCGTCAGTGA-3′，反义链：5′-AACCAGCGGAAGAGGTCAAGGG-3′(上海生工合成)。应用PCR试剂盒，PCR体系为25 μl，进行PCR。PCR条件：预变性94℃ 3 min，变性94℃ 30 s，退火62℃ 30 s，延伸72℃ 1 min，30个循环，总延伸72℃ 5 min。继以限制性内切酶37℃水解过夜，置4℃保存。用1.5%琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像分析系统中观察，照相记录结果。VDR Bsm1位点3种基因型：BB(800 bp)、Bb(800，650，175 bp)、bb(650，175 bp)。

1.4统计学方法 采用在线软件检测是否符合Hardy-weinberg平衡规律计算基因型和等位基因频率。采用SPSS12.0统计软件进行t及χ2检验。

2 结 果

2.1两组一般资料比较 两组性别比、年龄差异无统计学意义，T2DM组FPG、2 hPG、体重指数(BMI)均明显升高，差异均有统计学意义(P<0.05，P<0.01)，见表1。

表1 两组一般情况的比较

与正常对照组比较：1)P<0.05，2)P<0.01，下表同

2.2VDR Bsm1位点多态性结果判定 琼脂糖凝胶上电泳，酶切后PCR产物结果，显示800 bp一条带，用BB表示；显示800 bp、150 bp、650 bp三条带，用Bb表示；显示650 bp和150 bp两条带，用bb表示，见图1。

1：Marker;2:BB基因型；3：Bb基因型；4～6：bb基因型；7：正常对照组

2.3两组VDR Bsm1位点基因型及等位基因分布比较 两组基因型分布均符合Hardy-weinberg平衡。T2DM组中BB基因型出现频数为2，所以将BB、Bb基因型合并分析。T2DM组BB+Bb基因型明显高于正常对照组(37.33%vs 12.00%，P<0.05)，B等位基因频率明显高于正常对照组(19.34%vs 7.00%，P<0.05)，基因型bb明显低于正常对照组(62.67%vs 88.00%，P<0.05)，差异均有统计学意义(均P<0.05)。见表2。

表2 两组VDR Bsm1各基因型和等位基因分布比较〔n(%)〕

2.4T2DM组Bsm1各基因型临床特征的比较 与总体T2DM组相比较，BB+Bb组及bb组各基因型中，糖尿病家族史、高血压病史、发病年龄、BMI、HbA1c、TC、TG、LDL-C、HDL-C等临床特征均无统计学差异(P>0.05)。见表3。

表3 T2DM组VDR Bsm1基因组型临床特征的比较

3 讨 论

目前T2DM发病机制复杂，近年来大量研究证实，遗传易感性对胰岛素抵抗、胰岛素分泌起着重要作用〔5，6〕，T2DM是一种多基因遗传性疾病，寻找T2DM的易感基因是慢病防治工作的任务需要。

VDR基因是甾体类受体超家族中的一员，位于细胞核上，表达于皮肤、骨骼、小肠、肾、脂肪组织以及胰腺等，现有研究提示这些组织可能是维生素D的靶器官，VDR在胰腺的表达可能会影响胰岛功能，在骨骼肌和脂肪组织的表达可能会影响外周组织胰岛素的敏感性〔7〕。VDR基因由9个外显子和8个内含子组成，目前已经发现25个以上的限制性内酶酶切位点，最常见的是Fok1、Bsm1、Taq1和Apa1。

维生素D在肝脏经25-羟化酶作用后生成25-羟基维生素D，血液循环中25-羟基维生素D半衰期相对稳定，因此成为评估体内维生素D水平的主要指标。目前很多关于25-羟基维生素D对机体糖代谢异常调节机制的研究表明，T2DM患者伴随25-羟维生素D水平的下降，胰岛β细胞早期相胰岛素分泌和总体胰岛素分泌功能是进一步下降〔8，9〕。国外学者的体内外研究表明，在生理条件下糖代谢调节过程中，维生素D是葡萄糖刺激胰岛素分泌及维持正常糖耐量的必需物质之一，维生素D缺乏会减少葡萄糖负荷后的胰岛素释放，可增加糖调节受损，从而导致T2DM的患病风险增加〔10，11〕。研究表明，维生素D缺乏可通过细胞间钙离子的变化影响胰岛素的分泌和敏感性，这与糖原合成和葡萄糖转运蛋白(GLUT)-4的调节环节有关〔12〕。维生素D缺乏还会增加白细胞介素(IL)-1、IL-6和肿瘤坏死因子(TNF)-α等炎症细胞因子的表达，这将导致胰岛素抵抗的发生〔13〕。

1，25-二羟维生素D在机体中必须通过与VDR结合才能发挥其生理效应。T2DM患者维生素D缺乏与组织中VDR缺乏明显相关，VDR基因的改变导致T2DM发生的机制总结如下：血浆中钙离子代谢的改变及其对胰岛素合成和分泌的调节，VDR基因对脂肪组织功能的调节，VDR基因对胰岛素分泌的调节和对细胞因子表达的改变〔14〕。本研究结果表明VDR基因Bsm1位点多态性与中国吉林地区汉族人群T2DM密切相关，可能是该地区人群T2DM的一个易感基因，为从基因水平认识DM的发病机制提供了一个新的思路。国外学者对VDR基因对血脂水平的研究发现，维生素D受体与TC、TG、LDL-C水平呈负相关，与HDL-C 水平呈正相关性〔6〕。本研究结果考虑与种族差异有关，还有本研究样本量的影响。