澳洲坚果MYB1基因克隆及生物信息学分析

王文林 韦媛荣 郑树芳 谭秋锦 覃振师 黄锡云 汤秀华 樊松乐 王立丰 陈海生

摘要：【目的】從澳洲坚果（Macadamia integrifolia）叶片中克隆MYB1转录因子基因（MiMYB1）并进行生物信息学分析，为揭示R2R3-MYB家族转录因子成员在澳洲坚果中的抗逆作用机制提供参考依据。【方法】利用PCR从澳洲坚果品种桂热一号叶片中克隆MiMYB1基因，采用ProtParam、TMHMM Server v.2.0和SMART：Main page等在线分析软件对MiMYB1蛋白进行生物信息学分析，运用DNAMAN 7.0进行蛋白氨基酸多序列比对分析，并从NCBI中选取126个拟南芥R2R3-MYB家族成员，以Geneious Pro v4.8.4中的邻接法（Neighbor-joining，NJ）构建系统发育进化树。【结果】从澳洲坚果品种桂热一号叶片中克隆获得的MiMYB1基因序列全长1205 bp，包含1062 bp的开放阅读框（ORF），共编码353个氨基酸，GenBank登录号为MN254975。MiMYB1蛋白具有2个SANT保守结构域，属于R2R3-MYB家族，是无跨膜结构、无信号肽且定位于细胞核的不稳定亲水性蛋白。MiMYB1氨基酸序列（MN254975）与荷花NnMYB39氨基酸序列（XP_010277911.1）的亲缘关系最近，相似性为71.81%;与哥伦比亚锦葵HuMYB102-like（XP_021293847.1）、榴莲DzMYB102-like（XP_022777375.1）、木薯MeMYB102-like（XP_021596793.1）和高山栎QsMYB102-like（XP_023877052.1）的MYB氨基酸序列相似性分别为67.47%、68.63%、64.44%和67.28%。MiMYB1蛋白与126个拟南芥R2R3-MYB家族成员的系统发育进化分析结果显示，MiMYB1与AtMYB41的亲缘关系最近，与AtMYB41、AtMYB74和AtMYB102同属于S11亚族，具有相似的生物学功能，即与植物抗逆性功能相关。【结论】MiMYB1是典型的植物R2R3-MYB转录因子，在澳洲坚果的抗逆反应中发挥作用。

关键词： 澳洲坚果;MiMYB1基因;R2R3-MYB家族;SANT保守结构域;抗逆性

中图分类号： S664.9                          文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2020）02-0245-10

Cloning and bioinformatics analysis of MYB1 gene from

Macadamia integrifolia

WANG Wen-lin1， WEI Yuan-rong1， ZHENG Shu-fang1， TAN Qiu-jin1， QIN Zhen-shi1，

HUANG Xi-yun1， TANG Xiu-hua1， FAN Song-le2， WANG Li-feng2， CHEN Hai-sheng1*

（1Guangxi South Subtropical Agricultural Research Institute， Longzhou，Guangxi  532400， China; 2Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Rubber Tree， Ministry of Agriculture and Rural Affairs/State Key Laboratory Incubation Base for Cultivation & Physiology of Tropical Crops/Danzhou Investigation & Experiment Station of Tropical Crops， Ministry of Agriculture and Rural Affairs/Rubber Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou， Hainan  571101， China）

Abstract：【Objective】The MYB1 transcription factor gene（MiMYB1） was cloned and analyzed the structure and function by bioinformatics from Macadamia integrifolia leaves， which provided the theoretical reference for stress resistance mechanism of R2R3-MYB family transcription factor member M. integrifolia. 【Method】The MiMYB1 gene was cloned in the leaves of M. integrifolia variety Guire No.1 by PCR technique and followed by bioinformatics analysis， such as ProtParam，TMHMM Server v.2.0 and SMART：Main page online tools. Multiple sequence alignment analysis of protein amino acids was performed by DNAMAN 7.0. The phylogenetic evolutionary treewas constructed by 126 Arabidopsis thaliana R2R3-MYB members from NCBI with Neighbor-joining（NJ） method in Geneious Pro v4.8.4 software. 【Result】The cDNA sequence of MiMYB1（GenBank accession number：MN254975） gene obtained by cloning from Guire No.1 leaves was 1205 bp in length， had 1062 bp open reading frame（ORF）， encoding 353 amino acids. MiMYB1 protein had two SANT conserved domains belonging to the R2R3-MYB family. It was an unstable hydrophilic protein that had no transmembrane structure， no signal peptide and localizedto the nucleus. Phylogenetic analysis showed that the relationship between the amino acid sequence of MiMYB1 and the NnMYB39 in Nelumbo nucifera（XP_010277911.1） was the clo-sest， sharedidentity of 71.81%. It also shared identity of 67.47%，68.63%，64.44% and 67.28% with Colombian mallow HuMYB102-like（XP_021293847.1），Durio zibethinusDzMYB102-like（XP_022777375.1），Manihot esculenta Crantz MeMYB102-like（XP_021596793.1） and Quercus spinosa QsMYB102-like（XP_023877052.1）， respectively. The phylogenetic tree constructed by MiMYB1 protein and 126 A. thaliana R2R3-MYB members showed that MiMYB1 had the closest relationship with AtMYB41， and was clustered into S11 subfamily together with AtMYB41， AtMYB74， and AtMYB102. It indicated that they had similar biological function，relating to stress resistance functions. 【Conclusion】MiMYB1 is a typical plant R2R3-MYB transcription factor and plays a role stress resistance mechanism in M. integrifolia.

Key words： Macadamia integrifolia; MiMYB1 gene; R2R3-MYB family; SANT conserved domain; stress resistance

Foundation item： National Key Research and Development Project（2016YFC0502406）;Guangxi Science and Technology Base and Personnel Project（Guike AD18281087）;Basic Research Project of Guangxi Academy of Agricultural Sciences（Guinong-ke 2020YM46）;Chongzuo Science and Technology Project（Chongkegong 2019039）

0 引言

【研究意义】MYB基因家族是植物中最大的一类转录调控因子，按其保守结构域又可划分为4个家族，分别是R1/R2/R3-MYB、R2R3-MYB、R1R2R3-MYB和R-MYB，在植物生长发育、细胞形态、次级代谢和抗逆性等方面扮演着重要角色，涉及各种生物途径及生理反应（杨雪等，2018;关淑艳等，2019）。R2R3-MYB家族是MYB家族中成员最多且参与生物途径最广泛的一类，在低温、盐、干旱、病原体及昆虫攻击等生物或非生物胁迫反应中，R2R3-MYB家族转录因子通过调控基因表达而发挥核心作用（Zhang et al.，2018;樊松乐等，2019）。因此，研究R2R3-MYB家族成员的结构与功能对阐明植物抗逆机制、品种改良及促进其产业发展均具有重要意义。【前人研究进展】R2R3-MYB家族成员参与调控植物的初级代谢、次级代谢、细胞分裂与分化、生长发育及生物和非生物胁迫等生理过程（Dubos et al.，2010）。Lai等（2005）、Wang等（2015）研究发现，AtMYB124和AtMYB88参与拟南芥气孔细胞系的后期分裂过程及促进其根部向地性生长。Lepiniec等（2006）、Stracke等（2007）研究表明，AtMYB11/PFG1、AtMYB12/PFG1、AtMYB111/PFG3参与拟南芥黄酮类合成途径，而AtMYB123/TT2调控拟南芥种皮原花青素的生物合成。杨雪等（2018）从当归中克隆获得AsMYB4基因，并推测AsMYB4属于R2R3-MYB家族，作为转录抑制因子下调苯丙烷代谢途径中相关酶基因的表达。Ma等（2018）研究表明，MYB165是杨树黄酮类和苯丙烷类途径的主要抑制因子，且可能同时影响莽草酸酯途径。Shen等（2018）研究证实，R2R3-MYB型转录因子GsMYB15位于细胞核内，具有转录激活活性，其过表达能增强转基因拟南芥对盐胁迫和棉铃虫的抗性。Yang等（2018）研究发现，GmMYB181-OX拟南芥突变体改变了花器官形态、果实大小和植物结构，包括向外卷曲的萼片、较小的纤毛，同时增加侧枝和降低株高，说明GmMYB181参与了生殖器官的发育，在控制植物结构中发挥重要作用。Zhao等（2018）研究表明，小麦TaMYB31通过上调蜡质生物合成基因和干旱响应基因的表达而发挥作用。王莲萍等（2019）从白桦中克隆获得8个MYB转录因子基因（BpMYB1～BpMYB8），经生物信息学分析发现BpMYB1～BpMYB8均含有2个SANT结构，即属于R2R3-MYB家族，但在白桦生长发育过程中具有不同的功能。【本研究切入点】澳洲坚果（Macadamia integrifolia）是一种原产于澳大利亚东部亚热带雨林，兼具营养价值和药用价值的坚果作物，其富含不饱和脂肪酸（油酸和棕榈酸）和大量生物活性营养物质（蛋白质、矿物质、膳食纤维、抗氧化剂、植物甾醇及维生素E等）（王文林等，2013），在澳大利亚、南非、夏威夷、巴西和我国均有种植（Buthelezi et al.，2019;Herbert et al.，2019）。澳洲坚果对生长条件要求较高，温度低于10 ℃或高于30 ℃、降水量在1000 mm以下等均不利于其生长（Persak and Pitzschke，2013），且各种病虫害如花疫病、果壳斑点病、茎干溃疡、速衰病、蝽象类、蛀果蛾类、天牛类、蓑蛾类和白蚁类等会影响澳洲坚果的产量和品质（张瑞芳，2016;譚德锦等，2017;王文林等，2018），但至今鲜见有关澳洲坚果MYB家族转录因子成员结构及其在澳洲坚果抗逆和生长发育过程中的功能研究。【拟解决的关键问题】从澳洲坚果叶片中克隆MYB1转录因子基因（MiMYB1）并进行生物信息学分析，为深入研究澳洲坚果R2R3-MYB家族转录因子成员的结构和功能及揭示澳洲坚果的抗逆机制提供参考依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

供试澳洲坚果品种为桂热一号，来自广西南亚热带农业科学研究所澳洲坚果种质圃（东经106°79′84″， 北纬22°14′34″）。多糖多酚植株总RNA提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司;Ex Taq DNA聚合酶、反转录试剂盒、pMD18-T载体及DL2000 DNA Marker购自宝生物工程（大连）有限公司;凝胶回收试剂盒购自OMEGA公司。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 总RNA提取及cDNA合成 参照多糖多酚植物总RNA提取试剂盒说明提取澳洲坚果正常叶片的总RNA，采用Thermo Fisher NanoDrop 2000超微量核酸蛋白分析仪检测总RNA浓度和纯度，利用反转录试剂盒将其反转录合成cDNA，运用澳洲坚果内参基因MiACTIN检测cDNA质量，并以1.0%琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性及cDNA的浓度和纯度。

1. 2. 2 MiMYB1基因全长序列克隆 根据澳洲坚果转录组测序的编码区（CDS）序列，利用Primer 3.0（http：//primer3.ut.ee/）设计引物MiMYB1-F（5'-CGC CCTTCAATTGTTCTGTT-3'）和MiMYB1-R（5'-GCT CTTGTCTTGTGGCTCATC-3'），引物委托宝生物工程（大连）有限公司合成。PCR反应体系20.0 μL：1.0 μL cDNA模板（60 μg/L），2×Ex Taq PCR MasterMix 10.0 μL，上、下游引物各0.5 μL，ddH2O补足至20.0 μL。扩增程序：95 ℃预变性3 min;94 ℃ 30 s，55 ℃50 s，72 ℃，90 s，进行35个循环;72 ℃延伸10 min。PCR产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳检测后利用凝胶回收试剂盒进行回收、纯化，连接至pMD18-T载体后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，以含氨苄青霉素的抗性培养基进行筛选，挑取阳性克隆送至宝生物工程（大连）有限公司测序（陆燕茜等，2017）。

1. 2. 3 MiMYB1蛋白生物信息学分析 利用ProtParam、TMHMM Server v.2.0、SMART：Main page、SWISS-MODEL、DeepLoc-1.0、PSIPRED V4.0、SignalP-5.0 Server和MEME等在线分析软件对MiMYB1蛋白进行生物信息学分析，运用DNAMAN 7.0进行多序列比对分析;以Geneious Pro v4.8.4中的邻接法（Neighbor-joining，NJ）构建系统发育进化树（Bootstrap设为1000），用于系统发育进化分析的拟南芥及其他物种的MYB氨基酸序列均下载自NCBI。

2 结果与分析

2. 1 MiMYB1基因克隆及测序结果

从澳洲坚果叶片成功克隆获得MiMYB1基因全长序列的目的条带（图1），经测序得知MiMYB1基因序列全长1205 bp，包含1062 bp的开放阅读框（ORF），共编码353个氨基酸（图2）。将MiMYB1基因序列上传至NCBI数据库，获得GenBank登录号为MN254975。

2. 2 MiMYB1蛋白理化性质预测分析结果

利用ProtParam在线预测分析MiMYB1蛋白理化性质，得知其分子量为40312.00 Da，分子式为C1755H2741N503O559S15，总原子数为5573，理论等电点（pI）为5.63，带负电荷残基总数（Asp+Glu）为37个，带正电残基总数（Arg+Lys）为30个，不稳定系数为54.32（属于不稳定蛋白），脂肪族氨基酸指数为79.26，总平均亲水性系数为-0.665（图3），故推测MiMYB1蛋白是一个不稳定的亲水性蛋白。

2. 3 MiMYB1蛋白磷酸化位点、跨膜结构及亚细胞定位预测分析结果

利用NetPhos 3.1预测分析MiMYB1蛋白磷酸化位点，结果（图4）显示MiMYB1肽链中可能发生磷酸化且分值在0.5以上的氨基酸位点有42个，其中苏氨酸磷酸化位点10个、丝氨酸磷酸化位点24个、酪氨酸磷酸化位点8个。由于MiMYB1肽链以丝氨酸磷酸化位点为主，推测MiMYB1蛋白是以丝氨酸为主、苏氨酸为辅的磷酸化修饰调控其生物功能。

利用TMHMM Server v.2.0预测分析MiMYB1蛋白跨膜结构，结果表明MiMYB1蛋白无跨膜结构。利用SignalP-5.0 Server预测分析MiMYB1蛋白的信号肽，结果显示存在信号肽的概率为0.12%，故推测MiMYB1是非分泌蛋白（图5）。利用DeepLoc-1.0预测分析MiMYB1蛋白亚细胞定位，发现其定位于细胞核中的概率为1.0（图6）。

2. 4 MiMYB1蛋白保守结构域及二、三级结构预测分析结果

利用SMART：Main page预测分析MiMYB1蛋白保守结构域，得知存在2个SANT结构域和4个Low complexity，按其位置排序分别位于第13～63位、第66～114位、第127～150位、第179～199位、第286～299位和第302～321位氨基酸处（图7-A），因MiMYB1氨基酸序列具有2个SANT保守结构域，推测其属于R2R3-MYB家族。利用PSIPRED V4.0预测分析MiMYB1蛋白二级结构，结果显示其二级结构主要以α-螺旋和无规则卷曲为主（图7-B），分别占27.20%和62.61%。利用SWISS-MODEL預测分析MiMYB1蛋白三级结构，发现存在螺旋—转角—螺旋结构（HTH结构）（图7-C），与二级结构预测结果一致。

2. 5 MiMYB1蛋白的系统发育进化分析结果

对MiMYB1氨基酸序列（MN254975）与荷花NnMYB39（Nelumbo nucifera，XP_010277911.1）、哥伦比亚锦葵HuMYB102-like（Herrania umbratica，XP_021293847.1）、榴莲DzMYB102-like（Durio zibethinus，XP_022777375.1）、木薯MeMYB102-like（Manihot esculenta，XP_021596793.1）和高山栎QsMYB102-like（Quercus suber，XP_023877052.1）等MYB氨基酸序列进行同源性比对分析，结果（图8-A）显示对应的相似性分别为71.81%、67.47%、68.63%、64.44%和67.28%，与荷花NnMYB39的相似性最高。利用MEME鉴定分析MiMYB1氨基酸与其相似度较高的MYB氨基酸序列，找出排名前三的保守结构域Motif，并标注其在相关氨基酸序列的具体位置，如图8-B所示MiMYB1氨基酸序列的3个Motif分别位于第1～50位（a）、第77～126位（b）和第325～353位（c）。同时，将MiMYB1与126个拟南芥R2R3-MYB家族成员进行系统发育进化分析，结果显示MiMYB1与AtMYB41的亲缘关系最近，与AtMYB41、AtMYB74和AtMYB102同属于S11亚族（图9），故推测MiMYB1与该亚族成员具有相似的生物学功能，即与植物抗逆性功能相关。

3 讨论

R2R3-MYB亚家族是植物中发现最丰富的MYB家族，拟南芥基因组含有126个R2R3-MYB家族成员、荷花基因组含有116个、杨树基因组含有192个、玉米基因组含有157个、水稻基因组含有110个（Du et al.，2012;Tombuloglu，2019;Deng et al.，2016）。R2R3-MYB家族广泛参与植物的发育、代谢、衰老及防御等多个生物学过程，因此，研究澳洲坚果R2R3-MYB家族成员的结构与功能对揭示澳洲坚果产量形成和抗逆作用机制及促进澳洲坚果产业发展具有重要意义。本研究从澳洲坚果桂热一号叶片中成功克隆获得MiMYB1基因序列全长为1205 bp，包含1059 bp的ORF，编码353个氨基酸，其编码蛋白是一种具有2个SANT保守结构域、无跨膜结构、无信号肽且定位于细胞核的不稳定亲水性蛋白。将MiMYB1基因推导氨基酸序列提交到NCBI数据库进行BLAST比对分析，发现其与荷花NnMYB39氨基酸序列的亲缘关系最近，二者的相似性为71.81%。MiMYB1与126个拟南芥R2R3-MYB家族成员的系统发育进化分析结果表明，MiMYB1与AtMYB41亲缘关系最近，与AtMYB41、AtMYB74和AtMYB102聚类于S11亚族，说明MiMYB1是典型的植物R2R3-MYB转录因子。

已有研究表明，5种24-nt siRNA水平的变化是通过RNA指导DNA甲基化（RdDM）调控AtMYB74转录因子响应盐胁迫（Xu et al.，2015）。MPK6激活AtMYB41磷酸化以响应盐胁迫，而AtMYB41磷酸化是提高拟南芥耐盐性的必需条件（Hoang et al.，2012）。AtMYB41（At4g28110）可激活拟南芥和本生烟草（Nicotiana benthamiana）中的脂肪族软木脂合成及沉积细胞壁相关软木脂样片层，进一步证实AtMYB41在非生物胁迫条件下参与脂肪族软木脂合成（Kosma et al.，2014）。此外，De Vos等（2006）研究表明拟南芥R2R3-MYB转录因子AtMYB102对菜青虫幼虫摄食具有抗性;Zhu等（2018）研究发现拟南芥转录因子AtMYB102通过激活乙烯生物合成而提高植物对蚜虫的敏感性。可见，拟南芥S11亚族成员主要与植物对昆虫的抗性及渗透胁迫相关。本研究的系统发育进化分析结果表明，MiMYB1与AtMYB41、AtMYB74和AtMYB102的相似度较高;BLAST比对分析也发现MiMYB1氨基酸序列与荷花、哥伦比亚锦葵、榴莲、木薯和高山栎等物种的MYB1氨基酸序列亲缘关系较近，相似性在64.44%～71.81%。说明MiMYB1属于S11亚族，且在澳洲坚果的抗逆性中发挥作用，但具体抗逆机制有待进一步探究。目前，在其他植物也有类似的研究结论，荷花R2R3-MYB转录因子NnMYB5与其花色相关，在拟南芥中过表达NnMYB5基因会促进未成熟种子和花梗中花青素的积累（Sun et al.，2016）;过表达水稻OsMYB102基因的拟南芥突变体植株可延缓拟南芥叶片衰老，降低其抗逆性（Piao et al.，2019）。Ruan等（2017）利用RNAi技术得到MeMYB2突变体木薯，且发现该突变体木薯能提高其对干旱和冷胁迫的耐受性;在干旱和冷胁迫下，MeMYB2基因还影响其他MeMYBs基因及MeWRKYs基因的表达，说明在胁迫条件下木薯MYB和WRKY家族基因功能间存在交叉作用。鉴于拟南芥S11亚族成員与MiMYB1的亲缘关系，可确定MiMYB1参与澳洲坚果的抗逆反应，但尚需通过亚细胞定位、酵母自激活及遗传转化等技术进一步对MiMYB1的结构与功能进行验证。

4 结论

MiMYB1是典型的植物R2R3-MYB转录因子，在澳洲坚果的抗逆反应中发挥作用，为揭示R2R3-MYB家族转录因子成员在澳洲坚果中的抗逆作用机制打下了理论基础。

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