一株木榄内生真菌菌株的分类鉴定及其对铁皮石斛生长和多糖积累的影响

蓝桃菊 张艳 谢玲 陈艳露 张雯龙 黄昌艳

摘要：【目的】從红树植物内生真菌中筛选能促进铁皮石斛（Dendrobium officinale）生长的内生真菌菌株，并对其进行分类鉴定，为下一步开展铁皮石斛乃至其他特色作物专用菌剂（肥）开发利用提供理论依据。【方法】以北部湾红树植物内生真菌为研究对象，通过平皿和盆栽试验筛选对铁皮石斛具有优良促生作用的菌株，并综合形态学特征观察及ITS序列和18S rDNA序列分析结果对表现突出的促生菌株进行分类鉴定。【结果】从32株内生真菌中筛选获得对铁皮石斛具有良好促生效果的深色有隔内生真菌（DSE）菌株1株，该菌株分离自木榄（Bruguiera gymnorrhiza）茎，编号HS40;通过再分离及显微观察，发现菌株HS40可定殖于铁皮石斛根部并产生DSE的典型特征——微菌核和菌丝。盆栽铁皮石斛苗接种菌株HS40 6个月后，其株高、分蘖数、总鲜重、总干重和茎干多糖含量分别较对照增加21.7%、375.0%、94.7%、57.6%和15.8%，其中，株高、总鲜重、总干重和茎干多糖含量与对照相比达极显著差异水平（P<0.01），分蘖数达显著差异水平（P<0.05）。综合形态观察和序列分析结果，将菌株HS40鉴定为球腔菌科（Mycosphaerellaceae）的Zasmidium citri-griseum。【结论】菌株HS40可显著促进铁皮石斛的生长并提高其茎干多糖含量，有望用于开发铁皮石斛专用菌剂（肥）。

关键词： 铁皮石斛;深色有隔内生真菌;Zasmidium citri-griseum;促生;多糖含量

中图分类号： S182;Q939.96                       文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2020）02-0275-08

Identification of an endophytic fungus isolated from Bruguiera gymnorrhiza and its  effects on the growth and polysaccharide accumulation of Dendrobium officinale

LAN Tao-ju1， ZHANG Yan1， XIE Ling 1*， CHEN Yan-lu1， ZHANG Wen-long 1，

HUANG Chang-yan2

（1Microbiology Research Institute，Guangxi Academy of Agricultural Sciences， Nanning  530007， China; 2Flowers Research Institute， Guangxi Academy of Agricultural Sciences， Nanning  530007， China）

Abstract：【Objective】To select and identify endophytic fungus isolates from mangrove which could promote the growth of Dendrobium officinale， aiming to provide functional isolates and theoretical basis for the development of microbial inoculum or bacterial manure for D. officinale and even other special crops. 【Method】The endophytic fungi，isolated from mangrove plants in Beibu Gulf，were inoculated to D. officinale，growing both in Petri dishes and plastic cups，to evaluate their growth promoting capacity，and the fungi with good performance were identified based on morphological characteristics and sequences analysis of ITS and 18S rDNA gene. 【Result】An isolate of dark septate endophytes（DSE） having sound promotion effects on D. officinale，with the number of HS40 and being isolated from stem of D. officinale， was screened out from 32 endophytic fungi. The results showed that，HS40 could colonize in the roots of D. officinale，and the microsclerotium，typical characteristic of DSE，could be found in the root re-isolation and microexamination. Compared to that of non-inoculated plants（CK），the average plant height，number of new buds，total fresh weight，total dry weight and polysaccharide content in stems of the plants inoculated by HS40 after growing in the plastic cups for 6 months increased significantly by 21.7%，375.0%，94.7%，57.6% and 15.8%，respectively. The difference compared to control of plant height，total fresh weight，total dry weight and polysaccharide content reached extremely significant level（P<0.01）， and that of number of new buds reached significant level（P<0.05）. Based on morphological observation and sequence analysis mentioned above，isolate HS40 was identified as Zasmidium citri-griseum，which belonged to the family of Mycosphaerellaceae. 【Conclusion】Isolate HS40 can significantly promote D. officinale growth and improve polysaccharide content in its stems，thus，it might be further used in the production of microbial inoculum or bacterial manure for D. officinale.

Key words： Dendrobium officinale;dark septate endophyte;Zasmidium citri-griseum;growth promotion;polysaccharide content

Foundation item： Guangxi Science and Technology Development Fund（2015GXNSFBA139083）; Science and Technology Developmen Fund of Guangxi Accademy of Agricultural Sciences（GNK2017JZ43，GNK2018JZ05）; Basic Research Project of Guangxi Accademy of Agricultural Sciences（2015YT80）

0 引言

【研究意义】铁皮石斛（Dendrobium officinale）属兰科石斛属植物，被誉为“中华九大仙草”之首（方香香和张寿文，2014）。自然条件下铁皮石斛种子需与真菌共生才能正常萌发和生长发育，繁殖率较低，生长缓慢，加上生境遭受破坏和过度采集，铁皮石斛野生资源极度稀缺（李昊，2013）。因此，广泛收集、筛选铁皮石斛优良促生真菌并深入开展互作研究，有利于实现铁皮石斛的人工生态高效栽培，对保护铁皮石斛野生资源、促进铁皮石斛药材资源的可持续利用具有重要意义。我国拥有辽阔的海域，红树林（Mangrove）资源十分丰富，红树林分布面积约34472 ha，其中以广东省红树林面积最大，其次是广西（但新球等，2016）。加强对红树林内生真菌的研究既可丰富我国已知真菌资源宝库，又可为内生菌株在铁皮石斛乃至其他特色作物生产上的开发利用提供资源保障。【前人研究进展】红树林是热带、亚热带海岸潮间带特有的木本植物群落（张娆挺和林鹏，1984）。其生长环境独特，蕴藏着丰富的真菌资源。据报道，红树林真菌是海洋第二大真菌生态群（Xing and Guo，2011）。自20世纪末，Kohlmeyer和Volkmann-Kohlmeyer（1991）首次从澳大利亚红树林中分离到内生真菌以来，有关红树林内生真菌的研究主要集中在内生真菌多样性及其代谢产物方面（刘爱荣等，2007;高剑等，2013;徐静，2015;金黎明等，2017;周婧等，2019）。目前被分离鉴定的红树林内生真菌已超过280种（徐静，2015）。红树林内生真菌具有宿主专一性或广谱性的特点。Ananda和Sridhar（2002）从印度4种红树林植物中分离获得30种内生真菌，但未见同一种内生真菌同时分离自这4种植物;而周婧等（2019）报道，链格孢属（Alternaria）、曲霉属（Aspergillus）、枝孢属（Cladosporium）等10个属的内生真菌为红树、红海榄和红茄苳等3种红树植物的共同属。王桂文和李海鹰（2003）对4种红树植物根部丛枝菌进行研究，发现红树植物根中除有丛枝菌定殖外，还有一种具有很高定殖率的深色有隔真菌。相关研究表明，红树内生真菌可产生大量结构新颖且具有较强生理活性的化合物，主要包括生物碱类、内酯类、香豆素类和萜类等（高剑等，2013;徐静，2015;金黎明等，2017）。这些内生真菌代谢产物具有抗肿瘤活性，或具有抑制病原微生物、α-葡聚糖苷酶、乙酰胆碱酯酶（AchE）活性及杀灭线虫等不同功能（Klaiklay et al.，2012;李宁等，2013;Huang et al.，2016）。此外，还有少量关于红树植物内生真菌菌株生防功能研究的报道。彭琛（2005）研究发现，来自5种红树植物的141株内生真菌中有42株内生真菌至少对一种指示菌有抑制作用;杨定祥（2018）研究发现，分离自桐花根内的TH-T20菌株对辣椒疫霉防治效果较好且稳定。【本研究切入点】至今未见关于红树植物内生真菌对铁皮石斛等特色作物促生的研究报道。本课题组前期从广西沿海具有代表性的红树植物中分离获得41株内生真菌菌株（张艳等，2017）。基于部分红树林内生真菌宿主具有广谱性的特点，推测我国红树植物中可能存在可促进铁皮石斛生长的内生真菌菌株。【拟解决的关键问题】从红树植物内生真菌中筛选对铁皮石斛具有显著促生作用的菌株，并对其进行分类鉴定，以期为相关菌株在铁皮石斛乃至其他优势特色作物生产上的开发利用提供资源保障和技术参考。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

1. 1. 1 供试内生真菌 从北部湾山口国家红树林生态自然保护区、北仑河口红树林保护区等地木榄（Bruguiera gymnorrhiza）、 红海榄（Rhizophora stylosa）、 秋茄（Kandelia obovata）、桐花树（Aegiceras corniculatum）和白骨壤（Avicennia marina）等优势红树植物中分离获得。

1. 1. 2 供试铁皮石斛组培苗 由广西农业科学院花卉研究所提供，编号为784。

1. 1. 3 供试培养基 菌株活化、纯化培养分别使用麦芽汁培养基（CMMY，麦芽提取物10.0 g/L，酵母浸膏2.0 g/L，玉米粉琼脂8.5 g/L，琼脂7.5 g/L）和马铃薯葡萄糖固体培养基（PDA，马铃薯200.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，琼脂15.0 g/L）;菌株液体培养使用马铃薯葡萄糖液体培养基（PDB，马铃薯200.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L）;铁皮石斛苗平皿培养、真菌菌丝培养使用燕麦培养基（OMA，琼脂14.0 g/L，燕麦粉10.0 g/L，KH2PO4 1.5 g/L，MgSO4·7H2O 1.0 g/L，NaNO3 1.0 g/L）;鐵皮石斛苗根部内生真菌再分离使用1/2玉米粉培养基（1/2CM，玉米粉琼脂8.5 g/L，琼脂7.5 g/L）。

1. 1. 4 主要试剂和仪器设备 PCR试剂盒（2×Easy Taq PCR SuperMix）购自北京全式金生物技术有限公司;引物ITS1/ITS4和NS1/NS4的合成及DNA测序委托北京六合华大基因科技股份有限公司完成。MJX-250B霉菌培养箱购自天津市泰斯特仪器有限公司;DYY-8C型电泳仪、WD-9413C凝胶成像分析仪购自北京六一生物科技有限公司;东胜-ETC811基因扩增仪购自北京东胜创新生物科技有限公司。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 铁皮石斛促生菌株筛选

1. 2. 1. 1 平皿试验 菌株活化后，用灭菌手术刀将菌落均匀切成小块，按每皿3块接种于OMA培养基上，继续置于霉菌培养箱内培养14 d后备用。在超净工作台上，选取茎粗和株高基本一致的铁皮石斛无菌组培苗移栽至菌落上，每个培养皿移栽3株。每处理接种4皿，设4个重复，以未接种菌株而直接移栽铁皮石斛苗为对照处理。将移栽有铁皮石斛苗的培养皿放入组培瓶中，置于培养箱中进行共培养。培养条件：温度26 ℃，光照强度180 μmol/（m2·s2），光照时间16 h/d。考虑不同菌株菌丝生长速度存在明显差异，相关菌株被分成6批进行平皿培养。各批次均在培养60 d时测量株高、茎径、根长、鲜重和干重等指标，并观察内生真菌定殖情况。此外，参照Narisawa等（1998）的方法，取每个重复植株根部表面消毒后对内生真菌进行再分离，以确认分离菌株是否为接种菌株。

1. 2. 1. 2 盆栽试验 选取平皿试验效果较好的菌株进行盆栽试验。取长势一致的铁皮石斛组培苗，移栽至以消毒水草为培养基质的塑料杯中（杯口直径为5 cm），5株/杯，种植30 d时开始施用菌液。每杯施用菌液20 mL，间隔15 d再施用1次，共施用3次。每处理5杯，设4个重复，另以不施菌液为对照处理。菌液制备方法：将1.2.1.1所描述的菌块接种于PDB培养基后放置于温度26 ℃ 、转速150 r/min的摇床中进行培养，14 d左右过滤菌液收集菌丝团，将其粉碎后配制成浓度为5×105 CFU/mL的菌液。第1次施菌液后180 d取样，观察菌株定殖情况，测量不同处理铁皮石斛苗相关生长指标。

1. 2. 2 优良促生菌株对铁皮石斛多糖积累的影响

综合平皿培养和盆栽试验结果，并参考陈毓荃（2002）的方法，对综合表现良好的铁皮石斛苗进行茎干多糖含量测定。

1. 2. 3 优良促生菌株分类鉴定

1. 2. 3. 1 菌株形态学观察 参考谢玲等（2016）的方法，将菌株接种于CMMY培养基上，培养2周后观察菌落形态特征。同时，将灭菌盖玻片置于1.5%水琼脂培养基上，盖玻片中央放置一块0.5 cm×0.5 cm的OMA培养基，同时将菌株接种于OMA培养基上并于28 ℃下培养2周;以工作波长为365 nm的黑光灯间歇照射（12 h黑光灯照射，12 h黑暗），继续培养1个月左右，诱导其产孢后取出盖玻片用乳酸酚棉兰染色，在光学显微镜下观察菌株产孢结构及分生孢子形态。

1. 2. 3. 2 菌株分子鉴定 挑取CMMY培养基上的菌丝直接用于PCR扩增，ITS序列PCR扩增采用通用引物ITS1/ITS4;18S rDNA序列PCR扩增采用引物NS1/NS4/（White et al.，1990）。PCR反应体系50.0 μL：2×Easy Taq PCR SuperMix 25.0 μL，20 μmol/L上、下游引物各1.0 μL，模板DNA 1.0 μL（挑取少量菌丝），用ddH2O定容至50.0 μL。扩增程序：98 ℃预变性2 min;94 ℃ 40 s，50 ℃ 1 min，68 ℃ 4 min，進行30个循环;72 ℃延伸10 min。PCR扩增产物纯化后委托北京六合华大基因科技有限公司测序。

在GenBank中对获得的基因序列进行同源比对，下载最相似序列，使用MEGA 6.0中的邻接法（Neighbor-joining）构建系统发育进化树，并通过1000次Bootstrap循环检验系统发育进化树的可靠性（Jumpponen and Trappe，1998;Hou and Guo，2009;谢玲等，2016）。

1. 3 统计分析

采用 Excel 2010对试验数据进行整理统计，并以DPS 7.05进行方差分析。

2 结果与分析

2. 1 平皿试验结果

显微观察结果显示，接种供试菌株的铁皮石斛苗根部均可发现深色有隔内生真菌（Dark septate endophyte，DSE）的典型结构——微菌核和菌丝（图1），通过形态学观察后确定为原接种菌株，即相关菌株已与铁皮石斛苗建立了共生体。6批次的平皿培养结果显示，有30株菌株可促进铁皮石斛苗生长，铁皮石斛植株总干重均高于同一批次的对照，其中，包含菌株HS40在内的第一批次试验结果详见表1。分别接种HS40等菌株后，铁皮石斛苗总干重较同一批次对照总干重极显著提高（P<0.01，下同）。

2. 2 盆栽试验结果

选取平皿培养效果较好的菌株进行盆栽试验，结果显示，相关菌株均能与铁皮石斛建立共生体系，其中，接种菌株HS40的铁皮石斛苗整体长势较佳，且株高较一致（图2）。由表2可看出，接种菌株HS40的铁皮石斛株高、分蘖数、总鲜重、总干重分别较对照增加21.7%、375.0%、94.7%和57.6%，其中，株高、总鲜重和总干重与对照相比差异极显著，分蘖数与对照相比差异显著（P<0.05）。综合平皿培养和盆栽试验结果判断，菌株HS40的促生功能最稳定，效果也最佳。

2. 3 优良促生菌株HS40对铁皮石斛多糖积累的影响

多糖含量测定结果（图3）显示，接种优良促生菌株HS40的铁皮石斛苗茎干多糖含量比对照增加15.8%，与对照的差异极显著。可见，菌株HS40可显著促进铁皮石斛次生代谢产物多糖的积累。

2. 4 菌株HS40的形态学鉴定结果

菌株HS40的菌落形态及产孢结构见图4。铁皮石斛优良促生菌株HS40在CMMY培养基上长速一般，28 ℃下培养2周后菌落直径在25 mm左右，菌落圆形，呈辐射状凹陷，绒毡状，颜色呈灰棕色、黄褐色至褐色;菌丝浅黄褐色，有隔，直径1.4～4.0 μm。分生孢子梗为黄褐色，2～6个分隔，直立，无分枝，顶端常具1～3个突脐，近圆柱形，直立或稍弯曲，大小为23.2～154.2 μm×2.2～5.5 μm（平均69.1 μm×3.5 μm，n=54）;分生孢子浅黄褐色至黄褐色，近圆柱形或棍棒状，表面具疣，0～多隔膜，常以未分支的链状出现，大小为8.3～60.2 μm×1.8～3.6 μm（平均31.7 μm×2.8 μm，n=57）。上述特征与Zasmidium citri-griseum的形态特征基本相符（Braun et al.，2014;黄峰，2015）。

2. 5 菌株HS40的分子鉴定结果

通过菌株HS40的ITS片段扩增获得一条531 bp的基因序列，其GenBank登录号为KY496825。在GenBank中进行序列比对分析，结果显示菌株HS40的ITS序列与Zasmidium citri和Z. citri-griseum的ITS序列同源性分别为98.49%和98.29%。基于ITS序列同源性构建的系统发育进化树（图5）显示，菌株HS40以90%的支持率与Z. citri-griseum和Z. citri聚在一大支上。此外，采用NS1和NS4为引物进行18S rDNA序列扩增，获得一条1015 bp基因序列，GenBank登录号为KY576814，在GenBank进行序列比对分析，结果表明，菌株HS40的18S rDNA序列与登录号分别为KY873383、GU214597的Z. citri-griseum 18S rDNA序列同源性分别为100.00%和99.90%，基于18S rDNA同源性构建的系统发育进化树如图6所示，菌株HS40与Z. citri-griseum聚在一个分支上。结合形态学鉴定结果，将菌株HS40鉴定为Z. citri-griseum。

3 讨论

本研究首次尝试从北部湾红树植物内生真菌中筛选出能显著促进铁皮石斛生长的内生真菌，最终成功获得3株目标菌株，其中，菌株HS40的综合表现最佳。该菌株分离自广西北海市山口国家红树林生态自然保护区的木榄茎部，能成功定殖于铁皮石斛苗根部的皮层和外皮层，不仅未对铁皮石斛造成为害，还能促进铁皮石斛生长，说明该菌株与铁皮石斛间建立了共生关系，但具体的共生机制仍需深入探讨。此外，无论在OMA培养基上还是水草栽培基质中，菌株HS40对铁皮石斛苗均表现出良好的促生效果，且在盆栽条件下表现更明显。该菌株可显著促进铁皮石斛生长和多糖积累的表现与从兰科植物中分离获得的内生真菌表现（陈晓梅和郭顺星，2005;帅红艳，2008）基本一致。后续小规模应用示范结果也证明，菌株HS40可促进另一铁皮石斛品种的生长和多糖积累，进一步验证在挖掘铁皮石斛内生真菌资源时，可拓宽宿主植物的范围，也再次证明DSE宿主范围的广泛性（Wu and Guo，2008;Diene et al.，2010;Andrade-Linares et al.，2011）。

在本研究获得的3株铁皮石斛优良促生菌株中，仅有菌株HS40可产生孢子，可对其进行分类鉴定;而另外2株菌株一直以无性态存在，至今未能成功诱导其产生孢子，难以结合形态特征与分子鉴定结果对其进行精准鉴定。本研究通过形态特征分析，结合ITS序列、18S rDNA序列比对及系统发育进化树构建，并反复与Fisher（1961）、Whiteside（1972）、Crous等（2009）、Braun等（2014）、黄峰（2015）等的研究结果进行比较，最终将铁皮石斛优良促生菌株HS40鉴定为球腔菌科（Mycosphaerellaceae）平臍疣孢属（Zasmidium）的Z. citri-griseum。Z. citri-griseum与Cercospora citri-grisea属于基原异名，与Stenella citri-grisea、Z. citri属于同物异名（Braun et al.，2014;黄峰，2015）。本课题组前期研究红树植物内生真菌多样性时发现，菌株HS40与Z. citri（KF240807.1）的ITS序列同源性达98%，而与Z. anthuriicola（GU214595.1）的18S rDNA序列同源性高达99%（张艳等，2017）。进一步深入研究发现，菌株HS40的菌落形态特征、孢子梗、孢子形态特征均与Z. citri griseum更相符，且随着GenBank供参考信息的不断丰富，相关序列对比结果也支持菌株HS40与Z. citri-griseum属于同一个种的判断。

鉴于前人研究发现Z. citri-griseum分别属于柑橘属果树（Fisher，1961;Whiteside，1972;Braun et al.，2014;黄峰，2015）、桐花树（孙兴涛，2017）等植物的病原菌，因此在生产上对菌株HS40进行开发和应用前，要做好安全评估，以明确其适用范围。

4 结论

菌株HS40在平皿培养和盆栽试验中，对铁皮石斛的生长均表现出显著促进作用，且接种菌株HS40可显著提高盆栽铁皮石斛茎干多糖含量。该研究结论为菌株HS40在生产上的推广应用提供了数据支撑，为下一步开发铁皮石斛专用菌剂（肥）提供了理论依据，也可为内生真菌在广西其他特色作物上的开发应用提供参考。

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