NaCl胁迫对黑小麦根系DNA损伤的影响

陈瑞 唐秀梅 张琪 杨蓉 黄蕾蕾 任晴雯 朱森林 刘鹏

摘要：【目的】探究氯化鈉（NaCl）胁迫对黑小麦根系DNA损伤的影响，为寻求减轻环境因子对植物DNA损伤的方法及培育耐盐黑小麦品种提供参考。【方法】以黑小麦品种漯珍1号为材料，采用5个NaCl质量浓度（0、3、6、9、12和15 g/L）溶液处理黑小麦幼苗根系，通过彗星电泳试验，利用CASP 1.2.2分析代表黑小麦幼苗根系DNA损伤的尾部DNA含量、尾长和尾矩等指标。【结果】随着NaCl质量浓度的增加，彗星头部渐小，拖尾渐长，黑小麦根系DNA损伤片断的迁移水平逐步上升。尾部DNA含量、尾长和尾矩均随着NaCl质量浓度的增加呈升高趋势，在15 g/L处理下，三者的升幅分别达67.56%、139.40%和39.88%。随着NaCl质量浓度的增加，Olive尾矩（OTM）均有提高，但增长率慢慢下降，12～15 g/L的增长率降至5.42%，说明黑小麦具有一定的耐盐性。【结论】NaCl胁迫会引起黑小麦根系DNA损伤，且受损程度随着NaCl质量浓度的增加而愈发严重，但黑小麦对NaCl胁迫仍存在一定抗性。

关键词： 黑小麦;NaCl胁迫;彗星电泳;根系DNA损伤

中图分类号： S512.1                       文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2020）02-0299-06

Effects of NaCl stress on root DNA damage of black

kernel wheat

CHEN Rui1，2， TANG Xiu-mei3， ZHANG Qi1，2， YANG Rong1，2， HUANG Lei-lei1，2，

REN Qing-wen1，2， ZHU Sen-lin4， LIU Peng1，2*

（1Key Laboratory of Botany， Zhejiang Normal University， Jinhua， Zhejiang  321004， China; 2Research Institute of Ecology， Zhejiang Normal University， Jinhua， Zhejiang  321004， China; 3Cash Crops Research Institute， Guangxi Academy of Agricultural Sciences， Nanning  530007， China; 4Agricultural and Bioengineering Institute，Jinhua Polytechnic， Jinhua， Zhejiang  321007， China）

Abstract：【Objective】Effects of  sodium chloride（NaCl） stress on root DNA damage of black kernel wheat were explored in order to provide an important theoretical reference for finding a way to reduce the damage of environmental factors to plant DNA and salt tolerant black kernel wheat varieties breeding. 【Method】Using black kernel wheat （Luozhen No.1）as the materials，five NaCl mass concentrations（0，3，6，9，12 and 15 g/L） were set for black kernel wheat root treatment. This research was studied by comet assay. Indexes representing root DNA damage of black kernel wheat，such as tail DNA content，tail length and tail moment，were analyzed using CASP software. 【Result】The comet head was gradually becoming small and trailing gradually extended as NaCl concentration aggravated. Furthermore，the migration level of DNA damage fragments in the root increased. Tail DNA content，tail length and tail moment increased with the augment of NaCl concentration. Under 15 g/L treatment，the increases of tail DNA content，tail length and tail moment each were 67.56%，139.40% and 39.88%. With the increase of NaCl mass concentration，Olive tail moment（OTM）values increased but the increasing rate slowly declined，even fell to 5.42% between 12 g/L and 15 g/L concentration，indicating that black kernel wheat had certain salt tolerance. 【Conclusion】NaCl stress causes root DNA damage of black kernel wheat，and DNA damage enhances as the NaCl mass concentration increases， but black kernel wheat still has certain resistance to NaCl stress.

Key words： black kernel wheat; NaCl stress; comet assay; root DNA damage

Foundation item： National Natural Science Foundation of China（41571049）; Zhejiang Public Welfare Technology Application Research Project（2015C32127）

0 引言

【研究意义】小麦（Triticum aestivum L.）为禾本科小麦属一年生草本植物，其中黑小麦是独具特色的一类品种，其籽粒呈蓝色、紫色、深褐色或接近于黑色。黑小麦的氨基酸、粗蛋白、可溶性蛋白及膳食纤维等营养价值较高，各种矿质元素和维生素含量极丰富，是较突出的黑色食品资源之一（Sun et al.，2011），具有补钙、防癌、益寿、滋补的功效。但目前我国盐渍土分布十分广泛，土壤盐渍化严重危害农业生产和生态环境，盐胁迫对黑小麦的质量和产量造成严重威胁。因此，探索盐胁迫对黑小麦根系DNA损伤的影响，对于寻求减轻环境因子对植物DNA损伤的方法及培育耐盐黑小麦品种具有重要意义。【前人研究进展】国内外已有较多关于在逆境胁迫下植物DNA损伤的研究，主要涉及黄芪（姜志艳等，2013）、三七（朱美霖等，2014）和拟南芥（宋婕，2017）等植物。有研究表明，紫外辐射会引起烟草（Nicotiana tabacum L.）DNA受损（贾敬芬，2010）。在铜、镉等重金属胁迫下，随胁迫浓度升高植物DNA损伤逐渐严重（苟本富，2011;魏志琴等，2013）。目前与盐胁迫对植物影响相关的报道主要集中于耐盐性、染色体及基因表达、抗氧化损伤等方面。陈桂平等（2003）采用cDNA-AFLP技术，阐明小麦耐盐突变体在盐胁迫下基因表达的过程与差异。陈小燕等（2003）研究表明，氯化钠（NaCl）胁迫会引起染色体黏连、断裂及不均等分离等问题。杨飞等（2013）研究发现，NaCl胁迫会导致菘蓝（Isatis indigotica Fortune）DNA甲基化模式改变，部分DNA发生超甲基化和去甲基化。Zou等（2015）探明了壳寡糖（COS）可增强抗氧化活性，从而保护小麦免受盐胁迫的损害。【本研究切入点】目前，鲜见从分子水平探究NaCl胁迫对黑小麦DNA损伤情况的研究报道。【拟解决的关键问题】通过单细胞凝胶电泳试验，探讨黑小麦幼苗根系DNA在不同NaCl质量浓度处理下的损伤程度，并拍摄彗星图像，检测DNA损伤迁移部分的迁移长度、尾部DNA含量、尾矩、尾长及Olive尾矩，综合分析NaCl胁迫下黑小麦根系DNA损伤情况，为寻求减轻环境因子对植物DNA损伤的方法及培育耐盐黑小麦品种提供参考。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

供试黑小麦品种为漯珍1号，采自山东省泰安市优质黑小麦专业种植基地。供试土壤为浙江师范大学附近的农区酸性红壤，经检测土壤基本性状为：pH 5.97、有机质18.1 g/kg、阳离子代换量3.92 cmol/kg、水溶性盐总量2.66 g/kg、全氮0.54 mg/kg、水解氮22.90 g/kg、速效磷60.60 mg/kg及速效钾147.80 mg/kg。

1. 2 试验方法

分别挑选大小一致、颗粒饱满的黑小麦种子，经0.1%升汞溶液表面消毒后放入蒸馏水中，吸涨4 h后，播于铺有2层滤纸的培养皿（直径10 cm）内，每皿100粒。待种子萌发后，挑取发育健壮、长势一致的幼苗各15株，分别植于5 kg桶装土内，每桶施入基肥（尿素2.14 g、磷酸二氢钙1.17 g、氯化钾1.58 g、钼酸铵0.02 g、四硼酸钠0.04 g），用NaCl溶液处理土壤，共设5个NaCl质量浓度处理组，分别为T0（0 g/L，对照）、T1（3 g/L）、T2（6 g/L）、T3（9 g/L）、T4（12 g/L）和T5（15 g/L），每处理重复3次。在黑小麦整个生长时期均以蒸馏水灌溉。

1. 3 测定项目及方法

1. 3. 1 機械法分离细胞核 参考林爱军等（2005）机械分离法，取各NaCl质量浓度溶液处理过的幼苗根系放于预冷的玻璃培养皿中，并加入一定体积的磷酸缓冲液（PBS），用刀片在该缓冲液中轻轻将小麦根系竖直切开，使根系细胞核进入缓冲液，获得根系细胞核的悬浮液。为避免光线对试验结果的影响，所有操作均在红光灯下进行。

1. 3. 2 凝胶制备 参照郭炜（2008）单细胞凝胶电泳法，采用“三明治”琼脂糖凝胶进行电泳。将载玻片浸入PBS配制的1%正常熔点琼脂糖中，迅速取出，加盖玻片，4 ℃凝固10 min或室温凝固;取细胞核悬液50 μL和l%低熔点琼脂糖50 μL混合均匀，滴加到第一层凝胶上，加盖玻片，4 ℃凝固10 min;揭去盖玻片，将100 μL预热的0.5%岫滴加到载玻片上，加盖玻片。

1. 3. 3 裂解和电泳 参照张来军等（2010）的方法，将制备好的琼脂糖凝胶载玻片浸入碱性裂解液（2.5 mol/L NaCl，0.1 mol/L EDTA，10 mol/L HCl，1%肌氨酸钠，pH 10）中裂解0.5～3.0 h，之后用清水进行冲洗并放入水平电泳槽中，加入新配制的预冷碱性电泳液（0.00l mol/L Na2EDTA，0.3 mol/L NaOH，pH>13），在电压26 V、电流300 mA下电泳15～40 min。

1. 3. 4 中和及染色 电泳结束后，用0.4 mol/L Tris-HCl反复冲洗3次，每次5 min，滤纸吸干后在每张载玻片上加入30 μL溴化乙锭进行染色（Singh et al.，2009）。

1. 4 统计分析

运用SPSS 20.0中的单因素方差分析法（One-way ANOVA）和Duncans新复极差法进行差异显著性分析，采用Origin 8.5制图。彗星观察及数据分析在激发光546 nm、滤光片590 nm的条件下，用荧光显微镜观察（该条件下和溴化乙锭结合的DNA发出红色荧光），以CCD拍照获取彗星图像，并用CASP 1.2.2分析获取单个细胞核彗星试验的相关数据。

2 结果与分析

2. 1 NaCl胁迫对黑小麦根系DNA损伤的情况

黑小麦经不同质量浓度NaCl溶液胁迫后，通过电泳试验获得的彗星状图像（图1）显示，在相同电泳条件下，T0组细胞无拖尾现象，T1组拖尾并不明显。随着NaCl质量浓度的增加，拖尾渐长，迁移水平逐渐上升，揭示高质量浓度的NaCl胁迫对黑小麦根系细胞核DNA损伤有明显影响，彗星尾长均高于对照T0组，细胞核受损越来越严重，尤其是在15 g/L NaCl胁迫下拖尾现象最显著，说明高质量浓度NaCl胁迫会引起黑小麦根系DNA的破坏。

2. 2 彗星电泳图像各项指标分析结果

由图2可知，T0和T1组尾部DNA各项指标无显著差异（P>0.05，下同），说明低质量浓度NaCl胁迫下，黑小麦根系DNA几乎没有受损。但NaCl质量浓度超过6 g/L时，尾部DNA含量、尾长和尾矩等指标均明显上升，于15 g/L处理（T5）下达最大值，分别较T0组增加67.56%、139.40%和39.88%。其中尾长的升高趋势最明显，T1、T2、T3、T4和T5组尾长分别较T0组增加3.17%、29.85%、53.11%、122.83%和139.40%，且T2～T5组与T0组差异显著（P<0.05，下同）。表明NaCl质量浓度增加会加重黑小麦根系DNA的损害，即NaCl质量浓度与DNA损伤存在明显的剂量—效应关系。综上所述，低质量浓度NaCl胁迫下，黑小麦根系DNA损伤不明显，但随着NaCl质量浓度的增加，根系DNA的损伤状况不断加剧。

2. 3 DNA损伤程度代表值Olive尾矩（OTM）的变化曲线

OTM表示尾部DNA含量占总DNA含量百分比与头、尾部中心间距的乘积（何晶等，2008），可同时反映彗星拖尾中DNA含量和彗尾的形状特征，是DNA损伤定量化的常用指标（Lovell and Omori，2008）。从图3可看出，随着NaCl质量浓度的增加，黑小麦DNA的OTM不断增大，在15 g/L NaCl溶液处理（T5组）下达最大值，较T0组增加39.82%。当NaCl质量浓度小于3 g/L（T1组）时，根尖细胞中DNA损伤的OTM较小，属于轻度损伤范围，T1组的OTM增幅也不明显，表明几乎无DNA损害。相较于T0组，T1、T2、T3、T4和T5组的OTM分别提高1.77%、11.93%、21.28%、32.64%和39.82%。但其增长率波动下降，分别为1.77%、9.99%、8.35%、9.36%和5.42%。可见，OTM增长速度整体上较平缓，其最高增长率为9.99%（介于T1～T2），而在T4～T5的增长率降到5.42%，证明黑小麦具有一定的耐盐性。

3 讨论

断链DNA和碱易变性DNA片段在碱性溶液（pH>13）中会分解为单链向阳极移动，其迁移速度较未断裂DNA快，从而产生拖尾，形成彗星状图像（沈丹艳等，2013）。且DNA损害程度越大，迁移DNA量越多，迁移距离便越长，拖尾现象越明显（Collins，2017）。因此，彗星图像中的拖尾长度可评定细胞DNA损伤程度，确定外界作用因素与DNA损伤间的剂量—效应关系（Meng and Zhang，1998;宋超等，2013）。本研究结果显示，T1、T2、T3、T4和T5组与T0组相比，尾长分别增加3.17%、29.85%、53.11%、122.83%和139.40%，OTM分别提高1.77%、11.93%、21.28%、32.64%和39.82%。在低NaCl胁迫水平下，黑小麦根系DNA拖尾现象并不明晰，OTM较小，与张建新等（2017）研究发现的低浓度锰胁迫处理后臭牡丹（Clerodendrum bungei Sterd.）根系DNA拖尾不清晰，DNA损伤较弱的结论相似;姜志艳等（2013）对锌胁迫下黄芪[Astragalus membranaceus（Fisch.）Bunge.]的DNA损伤探索中也呈现出相似结果。这可能是由于黑小麦具有一定的DNA自身修复能力，Rowan等（2010）也曾指出RecA介导同源重组DNA修复机制是最具典型性的损伤修复系统。从彗星图像中可看出，随着NaCl质量浓度的增加，NaCl胁迫显著引起黑小麦根系DNA迁移，该趋势与沈丹艳等（2013）对铝胁迫下荞麦（Fagopyrum esculentum Moench.）根系DNA损伤的拖尾长度变化，公新忠等（2010）对铀胁迫下大豆[Glycine max （Linn.） Merr.]幼茎尾长变化探究均有较好的相关性。由此可知，低质量浓度NaCl胁迫处于黑小麦DNA损伤修复能力的承受范围之内，植株在一定程度上可适应NaCl胁迫环境，但高质量浓度（12～15 g/L）NaCl胁迫已超出其自身修复限度，从而导致黑小麦根系DNA明显迁移，拖尾长度变长，尾部DNA含量增加且OTM变大。

植物在外界非生物胁迫下，DNA会引起不同程度的损伤变异，甚至断裂（Waterman et al.，2006）。本研究结果表明，随着NaCl质量浓度的增加，黑小麦尾部DNA含量、尾长和尾矩均逐渐增大，与郭炜（2008）进行的紫外辐照胁迫会引起6种植物材料[柴胡（Bupleurm scorzonerifolium Willd.）、盐芥（The-llungiella salsuginea）、拟南芥（Arabidopsis thaliana （L.） Heynh.）、中間堰麦草（Thinopyrum intermedium （Hest）Nevski）、小麦（Triticum aestivum L.）和簇毛麦（Haynaldia villosa L. Schur.）]DNA损伤的研究结果相同。在本研究中显现出的拖尾长度及尾矩变化趋势，与高曦等（2014）对菲胁迫下蚕豆（Vicia faba L.）根尖细胞DNA损伤的探讨有较好的一致性。当NaCl质量浓度增加时，OTM逐步增长，黑小麦根系DNA的损伤程度逐渐加强，与魏志琴等（2013）探索铜胁迫下拟南芥根细胞DNA损伤的OTM变化规律相似。由此可知，尾部DNA含量、尾长、尾矩、OTM与NaCl质量浓度均具有明显的正相关性，高质量浓度NaCl胁迫对黑小麦根系DNA损伤影响显著大于低质量浓度NaCl胁迫，其间存在剂量—效应关系。

已有研究表明，NaCl胁迫下的丙二醛含量（王文银等，2017）、质膜NADPH氧化酶活性、抗氧化酶活性（周万海等，2015）等指标均可用于检测小麦对盐害的敏感度，但相关研究主要集中于植物生长发育的外在表现、内部结构、抗氧化酶系统及根系生态效应等方面，很少涉及分子层面。本研究从DNA分子水平出发，运用现代分子生物学技术综合分析，采用彗星电泳方法检测黑小麦在NaCl胁迫下的损伤程度并进行耐盐性鉴定，发现低质量浓度NaCl胁迫处理后的根系DNA拖尾不清晰，且OTM虽随着NaCl质量浓度的增加逐渐加大，但其增长率呈波动下降，6、9、12和15 g/L NaCl胁迫下，分别为9.99%、8.35%、9.36%和5.42%。说明其增长速度均较平缓，植株表现出一定的耐盐性，在张瑞富等（2007）的研究中也得到相似结论。综上所述，在一定质量浓度范围的NaCl胁迫下，黑小麦的OTM、尾部DNA含量和尾矩均呈波动下降趋势，表明其具有较好的耐盐性。

土壤盐渍化严重危害农业生态环境，降低土地资源利用率，进而影响农作物的产量和质量，造成巨大的经济损失。盐渍土的改良利用：一方面可将土壤盐含量降低到作物能适应的范围内，另一方面通过强化作物的耐盐能力，而适应土壤盐渍环境。在黑小麦的规模化生产中，可先选择对盐胁迫有一定适应能力的抗性品种，并重点考虑对作物生长具有显著影响的NaCl成分，结合黑小麦对其耐受程度，在盐渍化的种植土壤中，控制NaCl质量浓度低于3 g/L，以期获得最佳栽培效果。

4 结论

NaCl胁迫会引起黑小麦根系DNA损伤，且受损程度随着NaCl质量浓度的增加而愈发严重，但黑小麦对NaCl胁迫仍存在一定抗性。

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