猪圆环病毒3型河北株全基因组序列特征和遗传进化分析

2020-04-14王承玉李杰峰赵志强段宝宁杨威马玉忠

甘肃农业大学学报 2020年1期

王承玉，李杰峰，赵志强，段宝宁，杨威，马玉忠

(1.河北农业大学动物医学院，河北保定 071001；2.河北省畜牧兽医研究所，河北保定 071001；3.邯郸市饲料工业办公室，河北邯郸 056002)

猪圆环病毒是一种无囊膜共价闭合的单股环状负链DNA病毒，是目前已知最小的动物病毒[1]，属于圆环病毒科圆环病毒属[2].猪圆环病毒现有3个基因型：猪圆环病毒1型(PCV1)、猪圆环病毒2型(PCV2)和猪圆环病毒3型(PCV3)[3-4].PCV1是Tischer等[4]首次从猪肾传代细胞系(PK-15)污染的病毒中分离得到的不具有致病性的病毒.PCV2是从患有断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的猪群中分离得到的[5]，该病毒具有很高的致病性，其感染后会引起猪圆环病毒病(PCVD)，会对养猪业造成巨大的经济损失[6].2015年，北卡罗来纳州的一个农场母猪死亡率增加，爆发了猪皮炎肾病综合征(PDNS)，Palinski等[7]通过宏基因组测序，发现了新的猪圆环病毒，并将其命名为PCV3.随后在英国、波兰、意大利、韩国、中国也检测出该病[8-12]，截止到2018年，中国先后在山东、吉林、黑龙江、辽宁、广东、江苏等省市[12-16]相继检测到PCV3.PCV3的基因长度为2 000 bp，有11个开放阅读框(open reading frames,ORFs)，主要有两个编码蛋白，即ORF1(Rep)、ORF2(Cap)[17]，两者与PCV2的功能相似.ORF1是PCV上最大的编码区，编码与病毒复制相关的Rep蛋白，而ORF2编码与病毒结构有关的Cap蛋白，为主要的免疫原性蛋白.在我国PCV3有3a和3b两个亚型[18].目前对PCV3的相关研究很少，本文通过扩增一株PCV3的全基因组序列，对其序列特征进行分析，并将GenBank上所有的PCV3全基因组序列进行遗传进化分析，以期了解本毒株的结构特征，为进一步的致病机理研究及疫苗研制提供理论基础.

1 材料与方法

1.1 样品来源

选取2015年于华北地区采集的猪病变淋巴结进行PCV3病原检测.

1.2 主要试剂

DNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；2×ES Taq MasterMix(Dye)和DL2000 DNA Marker购自康维世纪生物科技有限公司；50×TAE缓冲液和琼脂糖购自索莱宝生物科技有限公司.

1.3 病毒DNA的提取

从病变淋巴结上取50 mg样品，置于1.5 mL离心管中，加入200 μL生理盐水，在匀浆仪上研磨，10 000 r/min离心1 min，取沉淀，提取DNA，最后加入100 μL TE缓冲液对DNA进行溶解，置于-80 ℃保存.

1.4 PCV3的检测

根据GenBank中的PCV3全基因组序列，利用NCBI在线引物设计平台设计一对特异性引物，引物序列为F：5′-TTGTGGTGCTACGAGTGTCC-3′；R：5′-CGTCTCCGTCAGAATCCGAG-3′，扩增片段大小为418 bp，引物由通用生物系统(安徽)有限公司合成.构建20 μL PCR反应体系：2×ES Taq MasterMix(Dye)10 μL、上游引物0.5 μL、下游引物0.5 μL、模板1 μL、ddH2O 8 μL.PCR的反应程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性20 s，57 ℃退火20 s，72 ℃延伸1 min，共30个循环；72 ℃延伸10 min.1.5%琼脂糖凝胶电泳，观察PCR反应结果.

1.5 PCV3全基因组序列扩增及测序

PCV3是一个环状DNA病毒，为了保证病毒扩增产物的完整性，参照文献[19]采用两对引物扩增其全基因组序列，PCV3-1-F：5′-TAGTATTACCCGGCACCTCGGAACC-3′，PCV3-1-R：5′-ACAGGTAAACGCCCTCGCATGTGGG-3′，扩增片段大小为1257 bp；PCV3-2-F：5′-TTGCACTTGTGTACAATTATTGCG-3′，PCV3-2-R：5′-ATCTTCAGGACACTCGTAGCACCAC-3′，扩增片段大小为1 075 bp,引物由通用生物系统(安徽)有限公司合成.构建50 μL PCR反应体系：2×ES Taq MasterMix(Dye)25 μL、上游引物1.25 μL、下游引物1.25 μL、模板2.5 μL、ddH2O 20 μL.PCR的反应程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环；72 ℃延伸10 min.1.5%琼脂糖凝胶电泳后成像观察PCR的反应结果.并将PCR产物送通用生物系统(安徽)有限公司进行测序.

1.6 PCV3河北株全基因组序列分析

利用Vector NTI软件绘制PCV3河北株全基因组的基因图谱，在GenBank中选取已发表的全部国内外PCV3毒株的全基因组序列，应用DNA Star软件包中的MegAlign和EditSeq软件对基因序列进行编辑、拼接，并对核苷酸序列进行同源性分析，利用MEGA-X软件的最大似然法进行遗传进化分析并生成基因进化树.

2 结果与分析

2.1 PCV3检测

利用检测引物，对病变淋巴结组织进行PCV3检测，1.5%琼脂糖凝胶电泳后成像结果见图1.淋巴结组织检测出PCV3，其条带大小为418 bp，因此选取其DNA作为PCR模板进行PCV3全基因组序列扩增.

2.2 PCV3全基因组序列扩增

为了获得PCV3全基因组序列，通过PCR技术对PCV3的DNA模板分两段扩增，1.5%琼脂糖凝胶电泳的结果显示成功扩增出两段序列，其条带大小分别为1 257、1 075 bp(图2～3).对PCR产物进行测序，获得1株PCV3全基因组序列，在GenBank上进行序列比对，并将其上传到GenBank(登录号：MK105924).

M：DL2000 DNA Marker；1：淋巴结组织；2：阴性对照.M：DL2000 DNA Marker；1：Lymph node tissue；2：Negative control.图1 PCV3检测结果Figure 1 PCV3 test results

M：DL2000 DNA Marker；1： PCV3-1的PCR产物；2：阴性对照. M：DL2000 DNA Marker；1： PCR product of PCV 3-1；2：Negative control.图2 PCV3-1的PCR产物Figure 2 PCR product of PCV3-1

M：DL2000 DNA Marker；1： PCV3-2的PCR产物；2：阴性对照. M：DL2000 DNA Marker；1： PCR product of PCV 3-2；2：Negative control.图3 PCV3-2的PCR产物Figure 3 PCR product of PCV3-2

2.3 PCV3河北株序列特征分析

对所获得的PCV3河北株绘制基因图谱(图4)，图4可以看到基因图谱主要有2个开档阅读框(ORFs)，分别为ORF1、ORF2，每个开放阅读框编码的蛋白质都大于200个氨基酸，在ORF1和ORF2之间被预测含有一个与PCV1相同的由9个碱基(TAGTATTAC)构成的茎环结构，ORF1和ORF2的编码方向相反，PCV1与PCV2的ORF1的起始密码子均为ATG，而在PCV3的ORF1中缺少一个标准的起始密码子(ATG).

在这两个主要的开放阅读框中，ORF1是最大的开放阅读框其编码了297个氨基酸，与PCV1和PCV2的REP蛋白及中国的蝙蝠圆环病毒的同源性分别为：51%、50.3%和51.9%.ORF2编码的Cap蛋白与Rep蛋白编码方向相反，其编码了215个氨基酸，与PCV1和PCV2的Cap蛋白及鸭圆环病毒的同源性分别为40.4%、40.6%和48.2%.

图4 PCV3河北株全基因组基因图谱Figure 4 Genomic map of PCV3 Hebei strain complete genome

2.4 河北省PCV3 Cap蛋白核苷酸序列同源性及遗传进化树分析

为深入分析PCV3河北株全基因组序列特征，将所获得的PCV3毒株的Cap蛋白与河北省其他9株PCV3的Cap蛋白进行核苷酸序列同源性和遗传进化树分析(图5～6)，从核苷酸序列同源性分析(图5)中发现这10株PCV3毒株的Cap蛋白的同源性在97.8%～99.8%，其中与河北株(GenBank登录号：MF318449)Cap蛋白同源性最高，为99.8%；在遗传进化树(图6)中，可看到有两个不同的分支，分为两个亚型3a和3b，其中所获得PCV3毒株的Cap蛋白为3b亚型，其与河北株(GenBank登录号：MF318448)和河北株(GenBank登录号：MF318449)处于一个大分支，而与河北株(GenBank登录号：MF318449)处于同一个小分支，说明其三者亲缘关系较近，而所获得的PCV3河北株与河北株(GenBank登录号：MF318449)亲缘关系更接近，且二者的核苷酸同源性也最高，为99.8%.

图右侧标注毒株信息为“地区-GenBank登录号”The information on the right side of the figure is “Region-GenBank Registration Number”.图5 河北省PCV3 Cap蛋白核苷酸序列同源性比较Figure 5 Comparison of nucleotide sequence homology of PCV3 Cap protein in Hebei Province

2.5 PCV3全基因组核苷酸序列同源性分析

为了探究PCV3河北株全基因组序列同源性，对所获得的PCV3毒株与其他国家及地区的43株PCV3和1株PCV1、1株PCV2的全基因组进行核苷酸序列同源性分析(图7).结果显示，所获得毒株与其他43株PCV3全基因组核苷酸序列的同源性在98.7%～99.3%，与国内其他省PCV3全基因组核苷酸序列的同源性在98.7%～99.1%，与国外PCV3全基因组核苷酸序列的同源性在98.8%～99.3%，由此可见全球PCV3的全基因组核苷酸序列之间的同源性都较高，与俄罗斯PCV3(GenBank登录号：MG679916)全基因组核苷酸序列的同源性最高，为99.3%；44株PCV3与PCV1、PCV2的全基因组核苷酸序列的同源性在46.1%～46.7%、45.9%～46.3%，与PCV1、PCV2全基因组核苷酸序列之间的同源性均低于50%，PCV1、PCV2和PCV3全基因组序列的同源性存在着较大的差异.

2.6 PCV3全基因组遗传进化树分析

为了对PCV3河北株全基因组序列进行遗传进化分析，对所获得的PCV3河北株与其他国家及地区的43株PCV3和1株PCV1、1株PCV2的全基因组进行基因进化树分析.由图8可看到有两个大的分支，PCV3处于一个分支，PCV1和PCV2处于一个分支，由此可得出PCV3与PCV1和PCV2的亲缘关系不近且属于两个不同的基因型，PCV1和PCV2在同一个分支其亲缘关系较近；PCV3大分支中又有两个小分支，分为两个亚型3a和3b，所获得的PCV3河北株为3b亚型，其与重庆PCV3毒株(GenBank登录号：KY075992)处于同一个小分支，亲缘关系更为接近.

图中标注毒株信息为“地区-GenBank登录号”The information marked in the figure is “Region-GenBank Registration Number”.图6 河北省PCV3 Cap蛋白遗传进化树Figure 6 Phylogenetic tree of PCV3 Cap protein in Hebei Province

图右侧标注毒株信息为“地区-GenBank登录号”The information on the right side of the figure is “Region-GenBank Registration Number”.图7 部分PCV3全基因组核苷酸序列同源性比较Figure 7 Comparison of the nucleotide homology of the complete genome among several PCV3 strains

2.7 全球PCV3全基因组遗传进化树分析

为了分析全球PCV3遗传进化特点，选取GenBank上已发表的全部国内外175株(包含所获得的PCV3河北株)PCV3的全基因组序列进行遗传进化树分析(图9～10)，同样有两个不同的分支，分为两个亚型3a和3b，通过基因进化树绘制表1和表2.由表1可知：国内和国外占全球PCV3总数的比例分别是61.1%和38.9%，北方和南方占国内PCV3总数的比例分别是25.2%和74.8%，亚洲、美洲和欧洲占国外PCV3总数的比例分别是30.9%、13.2%和55.9%，由次推断PCV3在国内外及各地区的分布存在着差异.由表2可知：北方和南方占国内PCV3a亚型总数的比例分别是18%和82%，北方和南方占国内PCV3b亚型总数的比例分别是31.6%和68.4%，北方的PCV3a和PCV3b占北方PCV3亚型总数的比例分别是33.3%和66.7%，由此推断PCV3亚型的分布在国内不同的地域存在着差异，且北方以PCV3b为多数；从国外PCV3亚型的数量可知：亚洲、美洲和欧洲占国外PCV3a亚型总数的比例分别是52.4%、44.4%和23.7%，亚洲、美洲和欧洲占国外PCV3b亚型总数的比例分别是47.6%、55.6%和76.3%，欧洲的PCV3a和PCV3b占欧洲PCV3亚型总数的比例分别是23.7%和52.4%，国外PCV3a和PCV3b占其总数的比例分别是35.3%和64.7%，全球PCV3a和PCV3b占其总数的比例分别是42.3%和57.7%，由此可知PCV3亚型的分布在国外不同的地域存在着差异，PCV3亚型分布在欧洲、国外及全球存在着差异，且以PCV3b亚型为多数.

图中标注毒株信息为“地区-GenBank登录号”The information marked in the figure is “Region-GenBank Registration Number”.图8 部分PCV3遗传进化树Figure 8 Phylogenetic tree several PCV3 strains

图中标注毒株信息为“地区-GenBank登录号”The information marked in the figure is “Region-GenBank Registration Number”.图9 国内南方和北方PCV3遗传进化树Figure 9 Phylogenetic tree of PCV3 strains in south and north of China

图中标注毒株信息为“地区-GenBank登录号”The information marked in the figure is “Region-GenBank Registration Number”.图10 亚洲、美洲、欧洲PCV3遗传进化树Figure 10 Phylogenetic tree of PCV3 strains in Asia,American and Europe

3 讨论

PCV3是一种新型病毒，其主要的临床症状表现为母猪流产、死胎和仔猪腹泻、皮炎等症状[7].自2016年在美国发现以来，欧洲地区[8-10]、日本、韩国[11]及中国等亚洲地区[12-16]也相继检测到PCV3，甚至泰国早在2006年就已经存在PCV3的感染[21].

表1 全球PCV3统计结果

表2 全球PCV3亚型数量表

本研究将从华北地区采集的病料作为阳性模板，通过PCR扩增其全基因组序列，获得1株新PCV3毒株.利用DNA Star和MEGA-X软件对河北省Cap蛋白，全球PCV3全基因组序列进行了核苷酸同源型和遗传进化树分析，以了解该病毒的序列特征、遗传进化和流行情况，为防治猪圆环病毒3型(PCV3)提供理论依据.

本研究将GenBank上已发表的所有河北省PCV3 Cap蛋白进行了核苷酸同源性及遗传进化树分析，其同源性在98.7%～99.1%，亲缘关系较近，且所获得的PCV3河北株为3b亚型.Cap蛋白是由ORF2编码的与病毒结构有关的蛋白，其在5′端包含一个茎环结构，且其含有214个氨基酸残基，比PCV2 Cap蛋白少19～20个氨基酸残基，目前对PCV3了解较少，需要进一步深入研究.

此外，本研究将GenBank上已发表的全部国内外175株(包含所获得的PCV3河北株)PCV3的全基因组序列进行核苷酸同源性及遗传进化树分析，其同源性在98.7%～99.3%，没有产生明显的变异，且由全球PCV3全基因组基因进化树中可以初步推断PCV3及其亚型的分布与地域有关，PCV3亚型的分布在北方、欧洲、国外和全球存在差异，而这仅仅是基于GenBank上现有的全部基因序列分析得出的结果，更加准确的结论需要大量的数据进行更进一步的分析.