龙牙楤木总皂苷对离体心脏缺血再灌注损伤的保护作用及机制研究

孙丽 宋欣丽 于梦 文超 鲁卫星

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是全世界冠心病发生和死亡的主要原因[1]，而且近年来呈现逐渐上升趋势，通过药物溶栓、经皮冠状动脉介入治疗、冠状动脉搭桥等方法使冠状动脉尽快恢复血供是目前最常用的治疗方法，也是降低急性心梗死亡率的主要措施。然而在复灌过程中心肌细胞的结构、功能会出现进一步损伤，甚至比缺血时更为严重，这种现象即为心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)[2-3]。研究结果表明，再灌注过程中NOD样受体蛋白3(NOD-like receptor protein3，NLRP3)炎症小体的表达量增加，且抑制NLRP3炎症小体后可以减轻心肌损伤、改善心脏功能[4-5]。

龙牙楤木为五加科植物，主要分布在中国东北地区，其根茎皮均可入药，味辛性平，具有益气活血、祛风除湿、安神止痛之功。研究表明，龙牙楤木总皂苷具有明显的抗心肌缺血再灌注损伤的作用[6-8]。本实验通过观察心率(heart rate，HR)、左心室发展压(left ventricular developed pressure，LVDP)、左心室内压最大上升速率(+dp/dtMax)、左心室内压最大下降速率(-dp/dtMax)变化，灌流液中肌酸激酶(creatine kinase，CK)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)、总超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量、心肌病理改变等探讨龙牙楤木总皂苷是否通过抑制NLRP3炎症小体发挥改善心肌缺血再灌注过程中心功能的作用。

1 材料与方法

1.1 动物

健康SPF级雄性Wistar大鼠48只，购于北京市维通利华，许可证号：SCXK(京)2016-0006。体重250～300 g，适应性喂养三天，随机分为4组，即假手术组、模型组、龙牙组、MCC950组(阳药组)，每组12只。

1.2 药品和试剂

龙牙楤木总皂苷由吉林中医药研究所提供；肝素钠注射液(江苏万邦生化医药集团有限责任公司)；戊巴比妥钠(美国Merck公司)；NLRP3炎症小体特异性抑制剂MCC950(美国MCE公司)；乳酸脱氢酶(LDH)测定试剂盒、肌酸激酶(CK)测定试剂盒、总超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒、丙二醛(MDA)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)；余分析纯试剂(国药集团化学试剂有限公司)。

1.3 仪器

Langendorff System(澳大利亚 AD Instruments Pty Ltd实验室)、恒温水浴(LETIC公司)、蠕动泵(Gilson公司)、压力传感器(澳大利亚 AD Instruments)、MP150多导联生理仪(美国Biopac)、PH仪(上海盛磁仪器有限公司)、医用二元气(95%O2+5%CO2)、5/0带线缝合针(上海医用缝合针厂有限公司)、硬膜外麻醉导管(广州金导医疗科技有限公司)、安全套(冈本珠式会社)。

1.4 改良Krebs-Henseleit(K-H)灌流液的配置

分别称取NaCl 6.90 g、NaHCO32.19 g、KCl 0.35 g、KH2PO40.16 g、MgSO40.14 g、CaCl20.14 g、C6H12O62.0 g，将除CaCl2以外的其他成分混匀至液体澄清，再加入CaCl2溶液搅拌均匀，用浓盐酸调节PH值至7.35～7.45之间，定容到1 L。

1.5 Langendorff离体心脏灌流模型制备

将大鼠称重，按1×103u/kg腹腔注射肝素钠，充分肝素化后按1 mg/kg腹腔注射3%戊巴比妥麻醉。固定动物，开胸暴露主动脉弓，眼科镊夹紧主动脉弓分支前，剪断主动脉，将取下的心脏放入0℃的K-H液中。提着主动脉断端插入Langendorff灌流套管中，并以0号线固定心脏。将恒温水浴预先设置到38℃，用含有95%O2和5%CO2的K-H液进行恒流灌注(10 mL/分钟)。剪开右心耳流出灌流液，待心脏正常搏动后，使用5/0带线缝合针在左心耳下方2 mm穿线。破开左心耳，将自制心室内压球囊放入左心室，压力感受器连接多导生理仪，记录心脏电生理活动，心脏功能稳定后，平衡20分钟。入组标准：心律齐，心率≥220次/分钟，左室收缩压≥60 mmHg[9]。假手术组：只穿线不结扎，以改良的K-H液持续平衡灌流105分钟；模型组：穿线结扎冠状动脉左前降支近分支处30分钟，K-H液复灌75分钟；龙牙组：穿线结扎冠状动脉左前降支近分支处30分钟，以含5 mg/L龙牙楤木总皂苷的K-H液复灌75分钟；MCC950组：穿线结扎冠状动脉左前降支近分支处30分钟，以含15 umol/L MCC950的K-H液复灌75分钟。

1.6 检测指标

1.6.1 2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-tripheny ltetrazolium chloride,TTC)染色 灌流结束后，取下心脏，去除多余组织，用吸水纸吸干心脏表面的水分，置于-20℃冰箱中存放20分钟，然后将心脏从心尖至心底部平均切成6片(厚约2 mm)，将切片置于1%TTC溶液，38℃避光孵育染色30分钟，后放入4%多聚甲醛中固定24小时。染色后正常心肌为红色，梗死心肌为灰白色。

1.6.2 血流动力学 采用Biopac MP150多导生理仪记录全程心率(HR)、左心室发展压(LVDP)、左心室内压最大上升速率(+dp/dtMax)、左心室内压最大下降速率(-dp/dtMax)。

1.6.3 灌流液中CK、LDH、MDA、SOD的含量 收集平衡20分钟、再灌注15分钟、再灌注75分钟的灌流液，-20℃保存备用。标本收集后按照试剂盒说明测定其含量。

1.6.4 苏木精-伊红(HE)染色 灌流结束后，取下心脏，4%多聚甲醛固定，石蜡包埋切片(厚约4 μm)，切片脱蜡至水，放入苏木素染10分钟，自来水冲洗，后放入伊红染液中染色2分钟，脱水封片，光镜下观察并拍照。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 心肌缺血再灌注模型的鉴定

与假手术组比较，模型组大鼠再灌注时出现心律失常、心肌收缩和舒张功能下降，见图1；模型组TTC染色显示灰白色梗死区，提示模型构建成功，见图2。

2.2 血流动力学影响

各组间平衡20分钟、局部缺血30分钟、再灌注15分钟、再灌注75分钟心率平稳，差异无统计学意义(P>0.05)。平衡20分钟，各组间LVDP、±dp/dtMax差异无统计学意义(P>0.05)；缺血30分钟，模型组、龙牙组、MCC950组LVDP、±dp/dtMax明显下降(P>0.05)，与假手术组比较差异具有统计学意义(P<0.05)；再灌注15分钟，龙牙组LVDP、±dp/dtMax明显上升，与模型组比较差异具有统计学意义(P<0.05)，与假手术组、MCC950组比较差异无统计学意义(P>0.05)；再灌注75分钟，各组LVDP、±dp/dtMax有所下降，龙牙组与假手术组、MCC950组比较差异无统计学意义(P>0.05)，与模型组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.3 心脏组织病理学改变

心脏组织HE染色显示：假手术组心肌细胞形态完整，排列规则，无炎性细胞浸润；模型组大量心肌细胞出现溶解、破碎，心肌纤维断裂，炎性细胞浸润；与模型组比较，MCC950组、龙牙组病理改变显著改善。见图3。

2.4 灌流液中CK、LDH的含量

假手术组平衡20分钟、再灌注15分钟、再灌注75分钟灌流液中CK、LDH稳定，差异无统计学意义(P>0.05)；平衡20分钟，各组间灌流液中CK、LDH稳定(P>0.05)；再灌注15分钟，模型组、龙牙组、MCC950组灌流液中CK、LDH明显升高，与假手术组比较，差异具有统计学意义(P<0.05)，与模型组比较，龙牙组、MCC950组差异具有统计学意义(P<0.05)，与MCC950组比较，龙牙组差异无统计学意义(P>0.05)；再灌注75分钟，与模型组比较，龙牙组、MCC950组灌流液中CK、LDH下降(P<0.05)，与假手术组比较，龙牙组、MCC950组差异无统计学意义(P>0.05)，与MCC950组比较，龙牙组差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

图1 假手术组、模型组大鼠再灌注时血流动力学改变

图2 模型组大鼠心肌TTC染色结果

表1 各组大鼠离体心脏血流动力学比较

注： 与假手术组比较，aP<0.01；与模型组比较，bP<0.05，cP<0.01。

注：A:假手术组；B:模型组；C:MCC950组；D:龙牙组

图3各组大鼠心脏组织病理学改变(HE×400)

表2 各组大鼠灌流中CK、LDH、MDA、SOD含量比较

注： 与模型组比较，aP<0.05，bP<0.01。

2.5 灌流液中MDA、SOD的含量

平衡20分钟；各组间灌流液中MDA、SOD稳定，差异无统计学意义(P>0.05)；再灌注15分钟，龙牙组、MCC950组灌流液中MDA含量较模型组明显减少，差异具有统计学意义(P<0.05)，再灌注75分钟时同样低于模型组(P<0.05)，龙牙组与MCC950组间比较无统计学意义(P>0.05)；与模型组比较，再灌注15分钟及75分钟时龙牙组、MCC950组灌流液中SOD含量较模型组明显增多，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表2。

3 讨论

心肌缺血再灌注损伤的发生机制与过度氧化、细胞内钙超载、炎症反应等有关[10]。本实验发现，龙牙楤木总皂苷可以减少氧自由基等有害物质对心肌细胞膜的损伤使心肌酶的溢出减少，增加SOD活性，降低MDA含量，从而升高缺血再灌注过程中LVDP、±dp/dtMax，促进心脏功能的恢复，且并无呈现再灌注时间依赖性。

龙牙楤木总皂苷是龙牙楤木中研究最多的活性成分，药理研究发现其具有抗心肌缺血、抗肿瘤、抗炎、降血糖、保肝、抗动脉粥样硬化等作用[11-12]。本课题组一直致力于龙牙楤木总皂苷抗心肌缺血再灌注方面的机制研究，目前发现龙牙楤木总皂苷通过抗氧化、降低CD40L表达、开放线粒体ATP敏感性钾通道等发挥抗心肌缺血再灌注损伤的作用[13-15]。

本实验研究结果表明，龙牙楤木总皂苷能够提高心肌缺血再灌注损伤后大鼠心脏LVDP、±dp/dtMax，显著降低灌流液中心肌酶CK、LDH的含量、增加SOD活性、降低MDA含量、减少心肌细胞破碎、心肌纤维断裂和炎性细胞浸润，提示龙牙楤木总皂苷可直接改善心脏功能，其机制可能是通过抑制NLRP3炎症小体激活，减少炎症反应及心肌酶的释放从而保护心肌。