迪庆藏猪Nramp1基因第二内含子和第二外显子多态性位点遗传分析

相德才，张 斌，刘邵娜，杨仁灿，赵彦光

（1.云南省畜牧兽医科学院，云南 昆明 650224；2.云南省种猪性能测定站，云南 昆明 650224；3.云南省种猪质量检验测试中心，云南 昆明 650224）

天然抗性相关巨噬蛋白基因（Natural resistance associated macrophage protein,Nramp1）由于其相对保守序列结构，对不同类型病原菌具有多效性，是研究免疫疾病的候选基因之一。1998年，Sun将猪Nramp1定位于第15号染色体的q23～26区域[1]。包含15个外显子和14个内含子，外显子分别编码8～12个转膜区域，全长序列大约15 kb，cDNA序列为1 617 bp，编码539个氨基酸[2]。Nramp1基因主要在脾脏、大脑和肺脏等网状内皮细胞器官的巨噬细胞中表达，用于抵抗外来病原微生物[3]。晏学明[4]在地方猪种的Nramp1基因的外显子1至外显子3之间发现了3个等位基因和4种基因型，并在藏猪的4个群体间发现了基因位点的遗传分化差异。

迪庆藏猪主要生活在云南省迪庆藏族自治州境内，主要以放牧方式进行饲养，对不良的生活环境具有良好的抵抗力且具有良好的肉品质，迪庆藏猪的这些特点是现有规模化养殖中引进猪种所不具备的。本研究以迪庆藏猪为研究对象，利用测序技术对Nramp1基因内含子2和外显子2进行SNP筛选，并对SNP位点进行遗传分析，为迪庆藏猪免疫疾病研究和抗病分子育种提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究随机挑选57头10月龄迪庆藏猪为试验材料，于2018年10月在迪庆藏族自治州迪庆藏猪保种场，采集其耳组织置于装有75%酒精的离心管中，-20℃保存。利用组织基因组DNA提取试剂盒提取耳组织基因组DNA，利用1%的琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA浓度。

1.2 引物设计

根据GenBank提供的猪Nramp1基因序列（NC_010457.5）， 用Primer Premier 5.0与 Oligo 6.0软件设计引物序列1对，引物序列为F：5'-TCATGA CAGGTGAGTAGCCC-3'，R：5'-CTTGGCCAGAGAGA TCCCAT-3'，扩增片段长度为735 bp，送英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。

1.3 PCR扩增和测序

PCR扩增体系总体积为25 μL，包含Mix 12.5 μL，正、反向引物（10 μmol/L）各 1 μL，基因组 DNA模板（约 50 ng）2 μL，8.5 μL ddH2O。 PCR 扩增反应条件为94℃预变性3 min；94℃变性30 s，60℃退火 30 s，72 ℃延伸 45 s，40个循环；72 ℃延伸 7 min；4℃保存。PCR扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测，而后送至中美泰和生物技术（北京）有限公司进行测序。

1.4 统计方法

采用genestar软件对测序数据进行分析比对，并用Excel对数据进行计算。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增结果和测序结果

PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统检测，结果见图1，由图1可见，扩增产物片段的特异性较好，大小约为735 bp，表明PCR扩增获得了想要的目的片段。

经过对测序结果的分析，由图2可知迪庆藏猪在Nramp1基因内含子2上存在6个SNP位点，分别是G841A、G892T、G1069A、G1085A、G1189A和T1347C；在外显子2上存在1个SNP，是A1377G。

2.2 基因频率和基因型频率分析和遗传特性分析

对各SNPs进行了基因频率、基因型频率、多态信息含量、纯合度、杂合度计算（表1）。结果显示，各位点在迪庆藏猪猪群中均处于Hardy-Weinberg平衡（P＞0.05）。群体遗传分析显示，本研究发现的SNPs多态信息含量处于低度多态和中度多态，G892T和 A1377G位点最高（0.357 5），G1189A位点最低（0.090 5）；杂合度均小于0.5，G892T和A1377G位点最高（0.466），G1189A位点最低（0.095）。

由图3可知，其中snp2与snp5、snp6和snp7，snp4与snp5，snp5与snp6和snp7之间的D′值接近1，说明这些位点间发生重组的可能性很小；snp1与snp6之间D′值接近0，说明两位点间连锁平衡的可能性很小；而D′值接近中间值的则无法比较两位点连锁平衡的差别。

表1 不同SNP位点基因频率、基因型频率、多态信息含量、纯合度、杂合度

单倍型分析结果如图4，常见单倍型有6种，累计频率为77.73%，其中单倍型1的频率为39.98%，单倍型2的频率为14.93%，单倍型3的频率为7.89%。

3 讨论

赵生国等[5]在Nramp1基因在外显子2上检测到2个等位基因（A和T）和3种基因型（AA、AT和TT）。本研究在迪庆藏猪Nramp1基因第2内含子和第2外显子一共发现7个SNPs，虽然本研究发现的非编码区突变位点并参与编码功能，但非编码区的突变对编码功能也有一定的作用，所以本研究发现的非编码区突变位点是否会影响迪庆藏猪Nramp1基因的表达和功能还需进行下一步的深入研究。

Nramp1基因作为控制动物抗病力性状的主效基因之一，在网状内皮细胞器官中的表达已被证实与沙门氏菌以及多种胞内寄生病原菌的抵抗作用有关[6]。通过本研究了解了迪庆藏猪Nramp1基因的变异情况及群体遗传特征，为下一步开展基因的遗传育种奠定了理论基础。经Hardy-Weinberg平衡检验，各SNPs均处于平衡，说明人工选择压较小，有利于发展下一步的抗病育种工作。

多态信息含量（PIC）和杂合度（He）是衡量等位基因多态性，基因突变变异程度高低的指标，也是群体内遗传变异大小的评定指标，数值越高，遗传变异越大。本研究发现所有的SNPs的多态信息含量和杂合度均小于0.5，说明群体内基因型遗传变异较小，选择潜力也比较小，为下一步研究Nramp1基因SNPs的基因型对沙门氏菌及多种胞内病原微生物的抵抗作用提供重要依据。