柠檬苦素调控Tiam1基因表达影响人体血管瘤内皮细胞VEGF/VEGFR2通路及诱导其凋亡的机制研究①

李立佳 符梅竹 黄惠敏 郑诗华 阎青青 张晓钿

(海南医学院第一附属医院儿科，海口 570102)

血管瘤是婴幼儿常见的良性肿瘤，多发于面颈部、四肢、口腔黏膜、肌肉、肝脏等[1]。随着年龄逐渐增长，部分患儿的血管瘤可自行消退，而另外一部分患儿的血管瘤则不断增殖，影响患儿的外貌和身心健康[2]。当前，血管瘤通常采用激光手术和药物等方式进行治疗，而其发病和消退机制尚不完全清楚。

Toonaciliatin A是一种柠檬苦素类似物，研究发现其能够抑制肿瘤细胞的增殖并诱导癌细胞凋亡[3,4]。T淋巴瘤侵袭转移诱导基因(T lymphoma invasion and metastasis inducing gene 1,Tiam1)是从小鼠T淋巴瘤细胞系中克隆出来的，在人类多种肿瘤细胞系中异常表达，与细胞的增殖、凋亡等过程密切相关[5-7]。研究发现，Tiam1在血管瘤增生期表达上调，与血管瘤增殖有关[8]。VEGF信号转导通路在血管瘤发展中发挥作用，血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和其受体VEGFR2在此通路中起重要作用[9]。VEGF及其受体在增生期的血管瘤标本中表达显著上调，与血管瘤的增殖密切相关[10]。

本课题以分离所得的血管瘤内皮细胞(hemangioma-derived endothelial cells,HemEC)为研究对象，采用不同浓度柠檬苦素类似物Toonaciliatin A处理HemEC，研究Toonaciliatin A对HemEC细胞增殖和凋亡的影响，及Tiam1基因和VEGF信号通路在此机制中的作用。

1 材料与方法

1.1材料 人血管瘤内皮细胞(HemEC)由分离所得；RPMI1640培养基和胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)购自Gibco公司，柠檬苦素类似物Toonaciliatin A购自上海诗丹德生物技术有限公司；pcDNA-Tiam1质粒由本实验组连接后测序验证；双抗、兔抗人第Ⅷ凝血因子抗体抗原、抗Tiam1抗体、抗VEGF抗体、抗VEGFR2抗体和抗β-actin抗体购自Abcam公司；胰蛋白酶Trypsin、胶原酶(collagenase)A、四氮唑蓝(MTT)和二甲基亚矾(dimethyl sulfoxide，DMSO)购自Sigma-Aldrich公司；Total RNA提取试剂盒、 Real-time PCR 试剂盒、反转录试剂盒(RT-PCR)购自美国Invitrogen公司；流式法细胞凋亡检测试剂盒、流式细胞仪购自美国BD公司，显微镜、全自动酶标仪及Real-time PCR仪购自美国Bio-Rad公司。

1.2方法

1.2.1细胞分离和培养[11]血管瘤标本取自海南医学院第一附属医院一女性患儿，年龄6个月，瘤体长势快。实验内容经患者监护人同意，并签订知情同意书。

将血管瘤标本用PBS缓冲液清洗3遍，然后剪碎(<1 mm3)，加入3倍体积的胶原酶A(0.2%)，37℃孵育1 h，将匀浆化的组织经100 μmol/L细胞过滤器过滤，加入NH4Cl溶解红细胞。然后再经40 μmol/L 细胞过滤器过滤，获得单细胞悬液。接种于含20% FBS、1% 青-链霉素的RPMI1640培养基中，于37℃ 5%CO2培养箱中常规培养，细胞培养至融合度90%左右，传代培养，传代至第3代后即可获取较纯的血管瘤内皮细胞(HemEC)，细胞鉴定存在第Ⅷ凝血因子相关抗原对其进行鉴定。待细胞培养至对数生长期时，无血清培养基培养48 h进行同步化处理，然后加入柠檬苦素类似物Toonaciliatin A(0、20、40、80 μg/ml)对细胞进行处理。

1.2.2细胞转染 待HemEC细胞培养至对数生长期，稀释为1×106个/ml，以每孔200 μl接种于6孔板中，培养至细胞融合度为80%～90%时进行转染。先用无血清OptiMEM培养液稀释脂质体Lipofectamine 2000、pcDNA和pcDNA-Tiam1(将Tiam1 cDNA插入pcDNA载体后测序验证)，之后取等体积脂质体和载体混合，轻轻混匀，室温孵育20 min，加入到培养好的细胞孔板中，混匀后置培养箱中继续培养，培养6 h，换成完全培养基，转染48 h后收集细胞进行后续实验。

1.2.3Real-time PCR检测mRNA的表达 将Toonaciliatin A处理或转染48 h的各组HemEC细胞进行收集，按照Total RNA提取试剂盒的说明书提取总RNA，测定浓度和纯度后于-80℃保存。然后按照反转录试剂盒说明书合成cDNA，反应程序为42℃45 min、70℃10 min；4℃放置10 min，合成的cDNA按照Real-time PCR的说明书进行反应，反应程序为：95℃ 5 min；95℃ 45 s、58℃ 30 s、72℃ 45 s，35个循环；72℃ 10 min。Tiam1 上游引物 5′-AAGACGTACTCAGGCCATGTCC-3 ′，下游引物 5 ′-GACCCAAATGTCGCAGTCAG-3′；VEGF 上游引物 5′-TTGACTGCTGTGGACTTGAG-3 ′，下游引物 5 ′-AGGACATAGGTCCTTTTAGG-3′；VEGFR2上游引物 5′-CCTACAAGTGCTTCTACCG-3′，下游引物 5 ′-TCAATCCCCACATTTAGTT-3′。运用Bio-Rad PCR检测系统进行数据分析，经内参照β-actin进行校正。

1.2.4MTT实验测定细胞生存率 将培养至对数生长期的HemEC细胞进行收集，分别加入终浓度为0、20、40、80 μg/ml的Toonaciliatin A后，再继续培养24 h、48 h、72 h，加入 20 μl(5 g/L)MTT，继续培养4 h，弃培养液，每孔加入150 μl DMSO溶解甲瓒结晶，室温振荡5 min，酶标仪测定OD492 nm 处的吸光度(A)值，按照公式生存率(%)=实验组A均值/control组A均值×100%，计算生存率。找出半数抑制浓度最佳条件。

1.2.5流式细胞术测定细胞凋亡率 各组HemEC细胞经Toonaciliatin A处理后，以每孔2×104个细胞接种于6孔板中，置于37℃ 5%CO2培养箱中培养72 h 后弃去培养液，胰酶消化，收集细胞，按照 Annexin V/PI 试剂盒说明书进行操作，加入 200 μl binding buffer重悬细胞，再加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl 碘化丙啶(PI)混匀，室温避光孵育20 min，用流式细胞仪测定细胞凋亡率。

1.2.6Western blot检测蛋白表达 将转染后经 Toonaciliatin A处理并培养48 h的各组HemEC细胞(对照组、柠檬苦素组、柠檬苦素+pcDNA组、柠檬苦素+pcDNA-Tiam1组)进行收集，加入RIPA 重悬细胞，冰浴超声破碎收集蛋白，测定总蛋白浓度。每个样本进行SDS-PAGE，然后转膜，室温封闭2 h，加入稀释的一抗(抗Tiam1 1∶500、抗VEGF抗体 1∶1 000 或抗VEGFR2 1∶1 000)，4℃孵育过夜，洗膜2次，加入1 000倍稀释的二抗，室温孵育1 h，以β-actin为内参照，分析蛋白表达水平。

2 结果

2.1Toonaciliatin A对人体血管瘤内皮细胞(HemEC)活性的影响 正常培养的血管瘤内皮细胞(HemEC)见图1。

本文根据参考文献[4]进行预实验；最终选用Toonaciliatin A致HemEC细胞存活率在50%附近的3个浓度(20、40、80 μg/ml)进行试验。

Toonaciliatin A处理人血管瘤内皮细胞(HemEC)24 h、48 h、72 h，MTT实验结果显示：与control组相比，20 μg/ml组、40 μg/ml组、80 μg/ml组在24 h、48 h、72 h细胞生存率显著下降(P<0.05)；与20 μg/ml组相比，40 μg/ml组、80 μg/ml组在24 h、48 h、72 h细胞生存率显著下降(P<0.05)；与40 μg/ml组相比，80 μg/ml组在24 h、48 h、72 h细胞生存率显著下降(P<0.05)，见图2。说明Toonaciliatin A能够抑制HemEC增殖。

2.2Toonaciliatin A对人体血管瘤内皮细胞凋亡的影响 流式细胞术实验结果显示(图3、表1)，与control组相比，20 μg/ml组、40 μg/ml组、80 μg/ml组细胞凋亡率显著上升(P<0.05)；与20 μg/ml组相比，40 μg/ml组、80 μg/ml组细胞凋亡率显著上升(P<0.05)；与40 μg/ml组相比，80 μg/ml组细胞凋亡率显著上升(P<0.05)。说明Toonaciliatin A能够促进HemEC凋亡。

2.3Toonaciliatin A对人体血管瘤内皮细胞Tiam1蛋白表达的影响 qRT-PCR和Western blot结果均显示，与control组相比，20 μg/ml组、40 μg/ml组、80 μg/ml组Tiam1表达量显著下降(P<0.05)；与20 μg/ml组相比，40 μg/ml组、80 μg/ml组Tiam1表达量显著下降(P<0.05)； 与40 μg/ml组相比，80 μg/ml组Tiam1表达量显著下降(P<0.05)，见图4和表2。说明Toonaciliatin A能够抑制Tiam1蛋白表达。

图1 正常培养的血管瘤内皮细胞Fig.1 Normally cultured hemangioma endothelial cells

图2 Toonaciliatin A抑制人体血管瘤内皮细胞活性Fig.2 Toonaciliatin A inhibited cell viability of HemECNote: *.P PP

图3 流式细胞术检测检测人体血管瘤内皮细胞凋亡Fig.3 Apoptosis of HemEC was detected by flow cytometry

GroupsCell apoptosis(%)Control5.85±0.4520 μg/ml13.88±1.071)40 μg/ml21.29±2.831)2)80 μg/ml26.42±3.111)2)3)F50.686P0.000

Note：1)P<0.05 vs control group;2)P<0.05 vs 20 μg/ml group;3)P<0.05 vs 40 μg/ml group.

图4 检测人体血管瘤内皮细胞Tiam1蛋白表达Fig.4 Expression levels of Tiam1 protein in HemEC

GroupsTiam1 mRNATiam1 proteinControl4.63±0.050.63±0.0920 μg/ml3.37±0.041)0.39±0.051)40 μg/ml1.71±0.181)2)0.25±0.031)2)80 μg/ml1.15±0.111)2)3)0.14±0.031)2)3)F621.85243.250P0.0000.000

Note：1)P<0.05 vs control group;2)P<0.05 vs 20 μg/ml group;3)P<0.05 vs 40 μg/ml group.

根据以上实验结果，选取处理时间48 h，抑制率为50%左右的Toonaciliatin A浓度(40 μg/ml)用作后续实验。

2.4过表达Tiam1 逆转Toonaciliatin A对HemEC的抑制作用 Western blot、流式细胞术和MTT结果显示，与control组相比，40 μg/ml组Tiam1表达量显著下降(P<0.05)，HemEC细胞凋亡率显著上升(P<0.05)，在24 h、48 h、72 h细胞生存率显著下降(P<0.05)；与pcDNA组相比，pcDNA-Tiam1组Tiam1表达量显著上升(P<0.05)，HemEC细胞凋亡率显著上升(P<0.05)，在24 h、48 h、72 h细胞生存率显著上升(P<0.05)；与40 μg/ml+pcDNA组相比，40 μg/ml+pcDNA-Tiam1组Tiam1表达量显著上升(P<0.05)，细胞凋亡率显著下降(P<0.05)，在24 h、48 h、72 h细胞生存率显著上升(P<0.05)，见图5和表4。说明过表达Tiam1逆转了Toonaciliatin A对HemEC的抑制作用。

图5 检测人体血管瘤内皮细胞Tiam1蛋白表达Fig.5 Expression levels of Tiam1 protein in HemECNote: *.P PP

GroupsTiam1 proteinApoptosis rate(%)Control0.63±0.066.18±0.7440 μg/ml0.26±0.031)22.46±1.681)pcDNA0.58±0.068.56±0.55pcDNA-Tiam10.84±0.082)3.29±0.342)40 μg/ml+pcDNA0.23±0.0224.29±2.4340 μg/ml+pcDNA-Tiam10.48±0.053)12.16±2.533)F55.80784.550P0.0000.000

Note：1)P<0.05 vs control group;2)P<0.05 vs pcDNA group;3)P<0.05 vs 40 μg/ml+pcDNA group.

2.5过表达Tiam1逆转了Toonaciliatin A对人HemEC细胞VEGF/VEGFR2通路的影响 Western blot结果表明，与control组相比，40 μg/ml组VEGF和VEGFR2蛋白表达量均显著下降(P<0.05)； 与pcDNA组相比，pcDNA-Tiam1组VEGF和VEGFR2蛋白表达量均显著上升(P<0.05)；与40 μg/ml+pcDNA组相比，40 μg/ml+pcDNA-Tiam1组VEGF和VEGFR2蛋白表达量均显著上升(P<0.05)，见图6和表5。说明Toonaciliatin A能够抑制VEGF和VEGFR2蛋白表达，过表达Tiam1逆转了Toonacili-atin A对VEGF和VEGFR2蛋白表达的抑制作用。加大Toonaciliatin A的用量会对HemEC细胞存活影响较大，对VEGF/VEGFR2通路的影响也较大，过表达Tiam1便不能恢复。

图6 检测人体血管瘤内皮细胞VEGF/VEGFR2通路蛋白表达Fig.6 Expression levels of VEGF/VEGFR2 pathway proteins in HemEC

GroupsVEGF proteinVEGFR2 proteinControl0.85±0.090.57±0.0640 μg/ml0.39±0.041)0.22±0.041)pcDNA0.72±0.070.48±0.05pcDNA-Tiam10.89±0.092)0.63±0.062)40 μg/ml+pcDNA0.41±0.030.23±0.0440 μg/ml+pcDNA-Tiam10.66±0.083)0.41±0.053)F27.32834.208P0.0000.000

Note：1)P<0.05 vs control group;2)P<0.05 vs pcDNA group;3)P<0.05 vs 40 μg/ml+pcDNA group.

3 讨论

早产、低体重、绒毛膜取样、孕期癫痫等因素会提高新生儿血管瘤的发生率[1,12]。血管瘤通常在婴儿出生后1周左右出现，在1岁内快速增殖，1岁左右逐渐消退，70%的患儿在7岁时都可消退，少部分继续增殖面积变大需治疗。血管瘤消退后可能出现瘢痕、萎缩、色素减退、血管扩张或皮肤松弛等症状，影响容貌，给患者及家属带来很大的心理创伤[2,13]。

柠檬苦素是引起柑橘苦味的重要物质，具有抗肿瘤增殖、抗菌性、镇痛消炎等作用[14,15]。Toonaciliatin A是一种柠檬苦素类似物，提取自思茅红椿(Toonaciliata Roem.var.henryi)[3]。丁怡等[4]研究表明，Toonaciliatin A能够抑制胃癌细胞增殖并诱导癌细胞凋亡。本研究发现，Toonaciliatin A能够抑制HemEC增殖，促进HemEC细胞凋亡，证实了Toonaciliatin A的肿瘤抑制作用。

Tiam1蛋白是鸟苷酸转换因子GEF家族成员之一，可以特异性激活Rho GTPase家族中的Rac1，在乳腺癌、膀胱癌、肺癌等多种肿瘤细胞中表达上调，且表达水平与肿瘤细胞的转移侵袭能力有关[16]。Liu等[17]发现，Tiam1通过Wnt/β-连环蛋白信号调节EMT促进甲状腺癌转移。丁轶[18]发现Tiam1在肝癌细胞中表达上调，在肝硬化组织中低表达，在正常肝组织中不表达，沉默Tiam1可抑制肝癌细胞的增殖和侵袭。刘涓等[8]研究表明，Tiam1在血管瘤细胞表达上调，对血管瘤的发生和发展密切相关。本研究结果表明，Toonaciliatin A抑制Tiam1蛋白表达，过表达Tiam1则逆转了Toonaciliatin A对HemEC的抑制作用，说明Toonaciliatin A通过抑制Tiam1表达进而抑制血管瘤细胞的生长。

VEGF是血管内皮生长因子，其主要靶细胞是内皮细胞，选择性刺激内皮细胞分裂，增加微血管通透性，改变细胞外基质，促进毛细血管穿透侵入组织内。VEGFR2是VEGF的受体2，通常低表达于正常组织的内皮细胞上。VEGF在肿瘤细胞、肿瘤相关巨噬细胞及增生期血管瘤中高表达，VEGFR2高表达于肿瘤血管内皮细胞[9,19]，抗VEGF/VEGFR用于肿瘤治疗[20]。Wu等[21]发现在乳腺癌中，沉默Tiam1会抑制VEGF表达，Tiam1通过VEGF、ERK和AP-1途径促进乳腺癌侵袭转移。王启船等[22]发现Tiam1和VEGF在食管鳞癌中高表达，两者可能促进食管鳞癌血管内皮细胞的增殖。本研究发现Toonaciliatin A能够抑制HemEC细胞中VEGF和VEGFR2蛋白表达，过表达Tiam1则会逆转Toonaciliatin A对VEGF和VEGFR2蛋白表达的抑制作用。说明Toonaciliatin A通过靶向Tiam1抑制HemEC细胞中VEGF/VEGFR2通路蛋白的表达，间接证实了Tiam1与VEGF/VEGFR2通路存在调控关系。另外本研究还发现，加大Toonaciliatin A的用量会对HemEC细胞存活影响较大，对VEGF/VEGFR2通路的影响也较大，过表达Tiam1便不能恢复。

本研究首次阐述在HemEC细胞中柠檬苦素类似物Toonaciliatin A靶向Tiam1基因抑制VEGF/VEGFR2通路蛋白表达，从而抑制HemEC细胞增殖，促进HemEC细胞凋亡。柠檬苦素对人血管瘤具有潜在治疗作用，本研究为人血管瘤的诊断和治疗提供新的思路，对血管瘤发生、增殖和消退机制的基础研究具有重要意义。