外源性硫化氢对2型糖尿病大鼠心肌纤维化及TGF-β1/Smads信号通路的影响①

曾奇虎 翁静飞 李小林 杨 萍 白 雪 范忠才

(西南医科大学附属中医医院,泸州 646000)

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是糖尿病患者心脏最主要的慢性并发症之一，早期表现为无症状性心室舒张功能减退、顺应性下降，逐渐发展到心室收缩功能障碍而出现心力衰竭的症状，最终发展为有明显症状的充血性心力衰竭，病理表现为心肌微血管病变、心肌细胞肥大、心肌胶原重构、心肌间质纤维化和进行性心肌细胞坏死和凋亡，其中以心肌胶原重构和心肌间质纤维化为DCM特征性病理改变[1]。目前认为外源性硫化氢(hydrogen sulfide，H2S)可能通过抑制ROS、NF-κB、内质网应激、凋亡、氧化应激等信号通路改善糖尿病心肌病大鼠心肌纤维化，延缓糖尿病心肌病的进展[2-4]，但其机制未完全阐明。众所周知，转化生长因子β1(TGF-β1)是一种多功能细胞因子，参与调控多种细胞的免疫、生长、分化、凋亡、自噬、肿瘤抑制等生物学进程，是致心肌纤维化关键因子。研究表明，TGF-β1可以调控下游Smads信号蛋白，介导细胞外基质(extracellular matrix，ECM)基因调控和聚集，参与心脏、肾脏、肺、肝脏等器官纤维化过程[5-8]。目前对外源性H2S是否参与糖尿病心肌病大鼠心肌纤维化过程及其机制尚不清楚，本实验拟构建2型糖尿病大鼠模型，观察外源性H2S对糖尿病心肌病大鼠心脏功能、心肌纤维化及TGF-β1/Smads信号通路蛋白影响，探讨外源性H2S对糖尿病心肌病作用及其可能的机制。

1 材料与方法

1.1材料 STZ(S0130)、NaHS(13590)购自美国Sigma公司。一抗：Ⅰ型胶原蛋白兔抗大鼠多克隆抗体(ab34710)、TGF-β1兔抗大鼠多克隆抗体(ab92486)、Smad7兔抗大鼠多克隆抗体(ab216 428)、GAPDH(ab37168)均购自Abcam公司。p-Smad2/3兔抗大鼠单克隆抗体(#8828)购自美国CST公司。HRP标记的羊抗兔二抗(SA00001-2)购自武汉三鹰生物技术有限公司，BCA蛋白浓度测定试剂盒(P0012)，RIPA裂解液(P0013B)和苯甲基磺酰氟 (PMSF，ST506) 等Western试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司，全自动生化分析仪(Beckman CX7，美国)。

1.2方法

1.2.1动物分组及药物处理 SPF级健康成年雄性SD大鼠47只，10～16周龄(体质量200～220 g)，由西南医科大学动物实验中心提供，生产许可证编号为SCXK(川) 2013-17，使用许可证编号为SYXK(川)2013-181，所有动物均饲养于西南医科大学附属医院动物实验室，后续实验在医院中心实验室完成。饲养环境:温度 23～26℃，相对湿度50%～60%，昼夜循环12 h，饲养期间自由进食和饮水。医院伦理委员会批准本研究实施，符合动物伦理相关规定。 27只成年SD雄性大鼠和20只成年SD雄性大鼠适应性喂养1周，然后分别予以高糖高脂饲料(成都达硕饲料公司按配方配制：10%猪油、20%蔗糖、6%蛋白粉、3%蛋黄粉、61%常规饲料)和普通饲料饲养4周，禁食12 h，高糖高脂饮食大鼠单次腹腔注射STZ 40 mg/kg(溶解于柠檬酸钠缓冲液中，pH=4.4)，普通饮食大鼠予以同等剂量柠檬酸钠缓冲液腹腔注射。注射后3 d 和5 d采尾静脉血测血糖，血糖≥16.7 mmol/L为2型糖尿病大鼠，且出现多食、多尿、多饮，提示构建2型糖尿病大鼠模型成功。造模成功后选取糖尿病大鼠20只，正常大鼠20只，采用随机数字表法分组为：正常对照组(Control组)、硫氢化钠对照组(NaHS组)、糖尿病组(DM组)、糖尿病+硫氢化钠组(DM+NaHS组),每组10只。造模成功后予以DM+NaHS组和NaHS组大鼠腹腔注射NaHS溶液100 μmol/(kg·d)，NaHS作为外源性H2S供体，予以Control组和DM组腹腔注射等量生理盐水，持续12周。实验结束时抽取空腹尾静脉血，使用全自动生化分析仪测空腹血糖(FBG)。各组大鼠予以腹腔注射3%戊巴比妥钠50 mg/kg麻醉，应用GE Vivi-E9心血管超高端彩超行心脏左心室功能评价。然后收集各组大鼠左心室心肌组织标本，部分用4%多聚甲醛溶液中固定，用于石蜡切片制备，余切成豌豆状放入-80℃冰箱冻存备用。

1.2.2左心室功能评价 测量各组大鼠左室舒张末期内径(LVEDD)、左室收缩末期内径(LVESD)，计算短轴缩短率(LVFS)、左心室射血分数(LVEF)和E/A ratio。

1.2.3Masson染色测定心肌间质胶原容积分数 各组石蜡切片常规脱蜡、脱水，按照Masson试剂盒说明书进行Masson染色。大鼠心肌细胞染色呈红色，心肌胶原纤维呈蓝色，使用光镜观察大鼠心肌结构及纤维化程度，应用Image Pro Plus 6.0软件测量测定各组心肌胶原容积分数(collagen volume fraction，CVF)。

1.2.4使用Western blot法检测心肌组织蛋白表达水平 取出-80℃保存的心肌组织，每100 mg加入预冷组织裂解液1 ml，超声破碎仪中(冰浴)匀浆后离心取上清液，使用BCA法检测蛋白浓度。充分混合的上清加5×蛋白上样缓冲液后于100℃煮沸变性 10 min，保存于-20℃冰箱。将变性好的组织样品冰上溶解后以10 μl总蛋白样品上样，SDS-PAGE电泳后使用半干法转膜至PDVF膜，用5%脱脂奶粉室温封闭1 h，洗去封闭液，洗膜3次，每次8 min。分别将已稀释一抗Ⅰ型胶原蛋白(1∶1 000)、TGF-β1(1∶1 000)、Smad7(1∶1 000)、p-Smad2/3(1∶1 000)4℃孵育过夜，用TBST(pH=7.6)洗膜3次，每次8 min；HRP标记的羊抗兔二抗(1∶3 000)37℃孵育1 h，TBST洗膜3次，每次8 min，ECL显色、曝光，保存胶片。使用Image J 1.8软件分析目的条带光密度值(OD)，使用GAPDH条带进行OD校正。

2 结果

2.1各组大鼠血糖及心功能影响 与Control组相比，DM组和DM+NaHS组大鼠FBG明显升高(P<0.05)。NaHS干预后，DM+NaHS组FBG较DM组降低(P< 0.05)，提示H2S能改善糖尿病心肌病大鼠血糖水平及心脏功能。见表1。

2.2各组大鼠心肌组织Masson染色结果 Control组CVF为(6.83±0.98)%，与Control组相比，DM组大鼠心肌组织排列紊乱，间质胶原纤维量显著增多，CVF(18.57±1.60)%明显增大(P<0.05)。与DM组相比，DM+NaHS组心肌组织排列紊乱和间质纤维化程度有明显改善，CVF(16.06±1.80)%明显减少(P<0.05)。见图1。

GroupsFBG(mmol/L)LVEDD(mm)LVESD (mm)LVFS(%)LVEF(%)E/A ratioControl4.36±0.567.20±0.693.94±0.6745.45±6.5476.50±2.681.56±0.12NaHS4.86±1.037.23±0.143.97±0.4245.08±6.3177.10±1.961.54±0.12DM25.13±2.581)7.80±0.361)4.79±0.291)38.54±2.921)64.8±2.941)1.25±0.131)DM+NaHS22.49±2.451)2)7.63±0.571)2)4.30±0.392)43.70±4.242)71.5±2.011)2)1.37±0.121)2)

Note:1)P<0.05 vs Control group；2)P<0.05 vs DM group.

图1 左心室Masson染色图片和心肌CVF定量分析

Fig.1 Representative images of left ventricular tissue sections stained with Masson′s Trichrome and Quantitative analysis of myocyte

Note: *.PPn=10.

图2 H2S对糖尿病大鼠TGF-β1/Smads信号通路蛋白及Ⅰ型胶原蛋白水平影响Fig.2 Effect of H2S on expression of TGF-β1/Smads signaling pathway and CollagenⅠprotein were measured by Western blot in diabetic ratsNote: *.P P

2.3各组心肌组织Ⅰ型胶原蛋白、TGF-β1、Smad7、p-Smad2/3蛋白表达的比较 与Control组相比，DM组大鼠心肌组织Ⅰ型胶原蛋白、TGF-β1表达水平和Smad2/3磷酸化水平明显增加，Smad7表达水平明显下调(P<0.05)。与DM组相比，DM+NaHS组心肌组织Ⅰ型胶原蛋白、TGF-β1表达水平和Smad2/3磷酸化水平明显下调，Smad7表达水平增加(P<0.05)。见图2。

3 讨论

目前糖尿病患者以2型糖尿病为主，是DCM主要人群，因此本实验通过构建2型糖尿病大鼠模型，研究2型糖尿病的DCM病理生理学及分子机制。糖尿病心肌病发病机制复杂，认为能量代谢障碍、线粒体的损伤与功能障碍、钙调节损伤、活性氧形成、炎症、细胞凋亡、心脏肥大和纤维化等参与心力衰竭的发生。本实验通过STZ联合高糖高脂饲料构建2型糖尿病，外源性H2S供体NaHS干预2型糖尿病模型12周，检测DM大鼠心脏彩超参数，心脏LVEDD、LVESD明显升高，LVEF、LVFS和E/A ratio明显降低，提示糖尿病大鼠心脏收缩和舒张功能明显下降；Masson染色显示，DM组大鼠心肌组织排列紊乱，间质胶原纤维量显著增多，CVF明显增加。以上证据符合DCM心肌功能及纤维化表现，提示DCM造模成功。

TGF-β1/Smads信号通路介导心肌间质纤维化已经成为目前研究热点，在心脏胶原合成与心脏纤维化起着关键性的作用。TGF-β1作为TGF-β的最重要生物学功能亚型，通过激活基于经典的Smads和非Smads信号通路诱导纤维化，导致肌成纤维细胞激活，ECM的过量产生和ECM降解的抑制[9]。阻断TGF-β1/Smads信号通路可以抑制Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白合成、肌成纤维细胞的增殖与分化，从而缓解心肌纤维化。Smad7是TGF-β1/Smads信号通路起负调控作用的关键信号分子，通过与TGF-β1受体结合阻止招募Smad3、Smad2及其磷酸化，抑制细胞信号转导与转录复合物形成，从而改善纤维化[10]。Yuan等[11]研究表明醛脱氢酶2酶活性的激活通过TGF-β1/Smads信号通路抑制成纤维细胞分化，从而改善心肌间质纤维化。曾强林等[12]研究发现TGF-β1/Smads信号通路是环孢素肾病模型小鼠肾间质纤维化重要机制之一。Shen等[13]研究证实，参松养心胶囊通过抑制糖尿病大鼠心肌TGF-β1、p-Smad2/3表达，上调Smad7表达，抑制心肌纤维化和改善心脏功能。本实验发现糖尿病大鼠心肌TGF-β1、p-Smad2/3明显上调，Smad7明显下调，CVF增加和心肌间质纤维化程度加重，心脏功能恶化。经H2S干预后，明显上调Smad7表达，下调TGF-β1、p-Smad2/3表达，使DCM大鼠CVF减低，心肌间质纤维化和心功能改善，提示H2S可能通过调控TGF-β1/Smads信号通路，改善DCM心肌纤维化，从而保护心脏功能。

众所周知，H2S是继一氧化氮和一氧化碳体内重要的细胞信号调控分子，内源性H2S可由半胱氨酸在多种酶催化作用下产生,具有松弛血管、抑制血管平滑肌细胞增殖、调节血管平滑肌细胞张力等作用[14]。近年来，大量研究证据表明，H2S在心血管系统病理学与生理学中扮演着重要作用[15]。外源性H2S可以通过调控氧化应激、凋亡等信号通路，抑制心脏成纤维细胞合成Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原，减缓ECM在心脏间质沉积，改善心脏纤维化，从而改善糖尿病心肌病大鼠心功能[2,3]。本实验也发现外源性H2S可以减少Ⅰ型胶原表达，改善糖尿病大鼠心肌间质纤维化，改善糖尿病大鼠心脏功能。

综上所述，通过本实验研究，笔者认为外源性H2S可能通过调控TGF-β1/Smads信号通路，介导心肌间质纤维化进而发挥保护心脏的效应，为DCM治疗提供新的途径和靶点。但本研究仅初步探讨外源性H2S对DCM作用及机制，需要继续对Smads家族其他信号蛋白分子和可能存在其他信号通路参与介导H2S对心脏保护作用机制深入研究。