补肾止颤方对6-OHDA诱导的帕金森病模型大鼠神经保护作用的研究＊

王炜为，高 晗，李文涛

（上海中医药大学附属市中医医院 上海 200071）

帕金森病（Parkinson's Disease，PD）是最常见的进行性中枢神经退行性病变之一，是老年人常见的以黑质-纹状体系统多巴胺功能不足为主要特征的中枢神经系统退行性疾病[1]。以震颤、强直、运动迟缓、步态姿势异常等运动症状和抑郁、便秘、嗅觉减退等非运动症状为主要临床表现，严重影响患者的生活质量[2]。该病多发生于50岁以上的老年人，发病率随着年龄增长而增加，在60岁以上的人群中发病率达1%，80岁以上人群中发病率达3%[3]。目前，治疗帕金森病的药物有左旋多巴、单胺氧化酶B 抑制剂、多巴胺受体激动剂、儿茶酚-O-甲基转移酶抑制剂等，主要用于改善帕金森患者的症状和生活质量[4,5]。中晚期药效逐渐减退，并发症逐渐显现。这些药物无法改善受损的多巴胺能神经元功能，也不能减缓黑质区多巴胺能神经元的退变。手术治疗虽然可作为中晚期治疗的手段，但由于是侵入性治疗，且成本高，使临床应用受到一定的限制[6]。严格的说，目前尚无临床有效的神经保护药物。

帕金森病属于中医“颤病”的范畴，肝肾亏虚是帕金森病的根本因素，补益肝肾药物在临床中应用广泛并取得较好疗效[7]。补肾止颤方来源于经典补肾名方六味地黄丸，有学者研究发现六味地黄丸治疗帕金森病有较好的效果[8-10]，且我们经过前期研究发现加味止颤汤（即止颤汤加补肾药）对帕金森病有一定的治疗作用，对非运动症状疗效更为显著[11]。在临床中我们发现补肾止颤方可以延缓疾病发展，可能有一定的神经保护作用。因此本研究采用6-羟基多巴胺（6-OHDA）两点注射法建立PD 模型，通过检测多巴胺能神经元数量以及中脑多巴胺及其代谢产物的水平，旨在进一步揭示补肾止颤方对多巴胺能神经元的神经保护作用，为临床上补肾止颤方治疗帕金森病提供理论依据。

1 实验材料

1.1 实验动物

雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，体重180-220 g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，SPF级，合格证编号：2015000513953，许可证号码：SCXK（沪）2012-0002。

1.2 实验药物

补肾止颤方颗粒剂，成分：熟地、山茱萸、山药、肉苁蓉，由四川新绿色药业科技发展公司提供。大鼠补肾止颤方用量：大鼠体表面积转换公式为6.3 × 成人用量 mg·kg-1，补肾方人体用量为 48 mg·d-1，大鼠灌胃量为504 mg·(kg·d)-1。

1.3 主要试剂与仪器

6-OHDA，抗坏血酸，阿扑吗啡（APO）（均购自sigma，美国），多巴胺转运蛋白（DAT）抗体（北京博奥森生物科技有限公司，批号：bs-20080R）和酪氨酸羟化酶（TH）抗体（北京博奥森生物科技有限公司，批号：bs-1714R），兔抗体免疫组化SP 试剂盒（南京凯基生物科技发展有限公司，批号：KGSP03），大鼠3,4-二羟基苯乙酸（DOPAC）、5-羟色胺（5-HT）、高香草酸（HVA）、单胺氧化酶B（MAO-B）、络氨酸羟化酶(TH)、多巴胺转运体（DAT）的ELISA 试剂盒（上海将来实业股份有限公司）。ZH-蓝星B 型脑立体定位仪（安徽正华生物仪器设备有限公司），10μL微量注射器（高鸽微量注射器，长沙市天心区雷磁仪器商行），正置荧光显微镜（德国LEICA，DM2500）。

2 实验方法

2.1 PD模型建立

SD 大鼠用10%水合氯醛（3.5 mL·kg-1）腹腔注射麻醉后，将其头部水平位固定于脑立体定位仪上，剪除颅顶鼠毛，用碘酒、酒精消毒皮肤，沿中线切开头皮，充分暴露颅顶前囟，参照Paxinos 和Watson 主编的《大鼠脑立体定位图谱》，保持前后囟水平，以前囟为坐标，确定右侧黑质致密部定位坐标：前囟后4.8 mm，矢状缝右侧1.8 mm，颅骨下8.2 mm；右侧中脑腹侧被盖区定位坐标为：前囟后4.8 mm，中线右侧1.0 mm，颅骨下8.2 mm。黑色记号笔标记。牙科钻小心钻透定位处的颅骨，暴露硬脑膜，按以上坐标将微量注射器针缓慢进针到预定深度，向黑质致密部和中脑腹侧被盖区注射配置好的6-OHDA（2 mg·mL-1）各 5 μL（含0.2%抗坏血酸），垂直入颅，缓慢进针，注射保持速度为1 μL·min-1，留针10 min，缓慢退针1 mm·min-1，术中观察大鼠生命体征。常规缝合皮肤，3 天连续腹腔注射青霉素5×104U 以防止感染。造模3 周后，腹腔注射0.1%阿扑吗啡（0.5 mg·kg-1），检测大鼠向健侧旋转的圈数，大于每分钟7 圈，为造模成功[12]，选取造模成功的80只模型大鼠和20只正常大鼠用于实验。

2.2 动物分组及给药

将大鼠分为正常组、模型组、补肾止颤方颗粒低剂量组（生药1.26 g·kg-1）、补肾止颤方颗粒中剂量组（生药2.52 g·kg-1）、补肾止颤方颗粒高剂量组（生药5.04 g·kg-1），每组 20 只。根据不同分组，补肾止颤方颗粒按照不同剂量溶于生理盐水中，每天中午灌胃1次。正常组和模型组予以相同体积的生理盐水灌胃。分别在造模成功后（即造模后3 周）给药，在给药第10天和第20天分别检测行为学和取材。

2.3 行为学检测

实验大鼠在最后1 次灌胃给药后，腹腔注射0.1%阿扑吗啡（0.5 mg·kg-1）诱发旋转行为（诱发大鼠向健侧旋转）。于阿扑吗啡注射后5 min 开始记录，共记录30 min。

2.4 多巴胺能神经元数量检测

免疫组化法检测黑质多巴胺能神经元标志物DAT和TH蛋白表达。每组随机取5只大鼠，心脏灌流固定后取脑，用于免疫组织化学检测。

2.4.1 脑组织的灌流固定

按大鼠体重，用10%水合氯醛进行腹腔注射麻醉，开胸暴露心脏，血管钳固定后剪开右心耳，先向左心室快速注射生理盐水150 mL，然后用4%多聚甲醛约250 mL灌注固定，先快后慢，大鼠会出现四肢、尾的抽搐，最终以肝脏发白、内脏鼓起、四肢颈项僵直即灌注好。断头，取脑，置于4%多聚甲醛固定液中，在4℃冰箱内保存。

2.4.2 石蜡切片的制备

将脑组织标本从固定液中取出，在黑质部沿冠状面切开脑组织，约2 mm。经脱水、透明、石蜡包埋脑组织后进行石蜡切片，片厚为6 μm，每个脑组织选取3张切片进行免疫组化染色。

2.4.3 免疫组化染色（按照免疫组化试剂盒说明书）

脱蜡、入水、抗原修复后，3%H2O2-甲醇室温孵育10 min，去除内源性过氧化物酶活性，PBS（Phosphate buffer saline）洗 5 min/次 × 3 次；用 10% 山羊血清封闭液封闭10 min，以减少非特异性吸附；吸出封闭血清，加入稀释好的一抗，一抗为兔抗TH 多克隆抗体（1∶200）和兔抗DAT 多克隆抗体（1∶200），室温下孵育 1 h 或 4℃孵育过夜。吸出一抗；PBS 洗，5 min × 3次；加抗兔生物素化二抗，室温孵育1 h；PBS 洗5 min×3 次；加辣根过氧化物酶（HRP）标记链亲合素，室温孵育10 min；PBS洗，5 min×3次。用DAB工作液显色2-5 min，显微镜下控制染色程度，自来水终止显色反应；苏木素复染。PBS充分冲洗后，中性树脂封片。显微镜下观察黑质中TH和DAT表达阳性的神经元。

2.4.4 结果分析

光镜下观察大鼠DAT、TH 的变化。在20 倍物镜下拍照，选取两个视野，计数右侧黑质致密部DAT、TH阳性细胞数面积，将每只大鼠的脑片取平均值为最后该大鼠DAT、TH阳性细胞数面积。

2.5 脑内多巴胺及代谢产物

ELISA 法检测：行为学实验后，每组随机取10 只大鼠，分别在第10 天和第20 天直接取脑，用于ELISA检测。取右侧黑质，加入一定量的PBS 匀浆。离心20 min，2500 r·min-1。仔细收集上清。分在酶标包被板上设置标准品，加样，用封板膜封板后置37℃温育30 min。小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30 s后弃去，如此重复5次，拍干。然后，每孔加入酶标试剂50 μL，空白孔除外。再次温育、洗涤，方法同上。接下来显色：每孔先加入显色剂A 50 μL，再加入显色剂B 50 μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15 min。每孔加终止液50 μL，终止反应。最后测定：空白孔调零，450 nm 波长依序测量各孔的吸光度（Optical density,OD）。测定应在加终止液后15 min以内进行。

图1 各组大鼠行为学变化

2.6 统计学分析

3 结果与分析

3.1 补肾止颤方对PD大鼠模型旋转行为的改善作用

在建立帕金森大鼠模型后3 周，阿扑吗啡诱导旋转，每分钟转圈数大于7 圈的为造模成功，进入实验。随着时间的增加，模型组大鼠转圈数逐渐增加；补肾止颤方处理后，PD 大鼠转圈数减少。和模型组相比，低剂量组在治疗第10 天转圈数无明显差异，在第20天转圈数明显减少（P＜0.05）；中剂量组和高剂量组PD 大鼠在第10 天转圈数明显减少（P＜ 0.05），且随着时间的延长，在第20 天，补肾止颤方组和模型组相比优势更加明显（P＜0.01）。另外中剂量组转圈数在第10 天和20 天之间没有差距，而高剂量组20 天比10 天转圈数减少（图1），说明在治疗一段时间后加大中药的剂量可能对帕金森的治疗更有益处。以上结果表明补肾止颤方能够改善PD 大鼠的行为学，中高剂量疗效较好。

3.2 补肾止颤方对PD 大鼠模型脑内多巴胺神经元数量的影响

图2 免疫组化法检测不同组别右侧大脑黑质区DAT和TH阳性细胞

表1 免疫组化法和ELISA检测不同组别右侧大脑黑质区DAT和TH表达水平

PD 大鼠经过相应的处理后，分别在第10 天和第20 天免疫组化和ELISA 法检测右侧黑质区TH 和DAT的表达情况。TH 是多巴胺合成的限速酶，DAT 将神经递质多巴胺从突触间隙泵出回细胞质，TH 和DAT的表达量可以反映多巴胺能神经元的数量。研究结果如下（图2、表1）：两种检测方法均显示PD 模型组右侧黑质区TH 和DAT 的表达较正常组明显下降（P＜0.01），说明造模成功。补肾止颤方治疗后，TH 和DAT的表达水平较模型组升高，尤其是中剂量组和高剂量组（*P＜ 0.05，**P＜ 0.01）。说明补肾止颤方能够增加PD大鼠模型多巴胺能神经元的表达。

3.3 补肾止颤方对PD模型大鼠脑内代谢产物的影响

ELISA 法检测大鼠脑内相关代谢产物的变化情况，HVA 和DOPAC 是多巴胺代谢产物，可以反映多巴胺水平；5-HT 与运动协调功能密切相关；而MAO-B是多巴胺分解代谢过程中的关键酶之一，可产生活性氧，导致细胞损伤。结果显示（表2）：PD 大鼠造模后，5-HT、DOPAC 和 HVA 的表达均降低，MAO-B 的表达升高（##P＜ 0.01）。补肾止颤方处理后，5-HT、DOPAC 和 HVA 的表达较模型组升高，MAO-B 的表达相对降低，尤其是中高剂量组（*P＜ 0.05，**P＜ 0.01）。这个结果表明补肾止颤方能够增加代谢产物DOPAC、5-HT、HVA 的表达且抑制 MAO-B 的表达，保护多巴胺能神经元。

表2 大鼠右侧黑质致密部DOPAC、5-HT、HVA含量

4 讨论

帕金森病尽管临床症状多样，根本原因还是黑质多巴胺能神经元的缺失。目前的治疗方法均以改善症状为主，神经修饰治疗的药物没有被指南推荐，说明还缺乏多巴胺能神经元保护的药物，而只有神经保护治疗才有可能阻止或延缓疾病的发展，是帕金森病的根本性治疗。

帕金森病属中医颤病范畴，病机虚实夹杂，错综复杂，抓住根本病机施治，是对帕金森病进行根本治疗的关键。早在《内经》中就有“诸风掉眩，皆属于肝”的记载，认为肝肾亏虚是震颤类疾病的根本内因[13]。临床荟萃分析的证候研究也发现，“肝肾亏虚”是帕金森病最主要的证候[14]。肝肾同源，肝肾阳虚较少，肝肾亏虚以肝肾阴精不足为主要原因。临床研究也证明，在帕金森病患者中肾阴亏虚为主要证候要素[15]。临床研究表明补肾阴经方如六味地黄丸可以改善帕金森病患者的运动及非运动症状[10]，显示出一定的治疗帕金森病的作用。该方补肾阴为主，切中帕金森病的根本病机，可能有保护神经细胞，减缓帕金森病发展的作用。

补肾止颤方来源于经典补肾名方六味地黄丸，我们在临床中发现其对帕金森病人有一定的神经保护作用。为了进一步验证补肾止颤方治疗帕金森的机理，本研究采用6-OHDA 两点注射法建立PD 模型。因为纹状体多巴胺系统破坏后，突触后膜的多巴胺受体因失神经支配而敏感性增高，此时应用多巴胺受体激动剂使损伤侧兴奋作用占优势而产生向健侧旋转。因此在模型构建3周后，利用多巴胺受体激动剂-阿扑吗啡诱导大鼠转圈，并以大鼠旋转圈数大于每分钟7圈为指标以确定造模成功与否。结果表明，造模后大鼠转圈数增加，同时，TH、DAT、DOPAC、HVA 及5-HT的表达均下降而MAO-B 的表达增加。经补肾止颤方干预后，我们发现不同剂量的补肾止颤方均显示了较好的改善PD 模型大鼠旋转行为的作用，以中高剂量疗效为著，说明补肾止颤方可以减轻PD 大鼠多巴胺系统的损毁程度，改善PD大鼠的行为学（图1）。

为了进一步明确补肾止颤方对多巴胺能神经元的作用，分别用免疫组化法和ELISA 法检测TH 和DAT 的表达情况。络氨酸羟化酶（TH）是多巴胺合成的限速酶，它在黑质纹状体的水平直接影响多巴胺的合成[16]；多巴胺转运体（DAT）是一种跨膜蛋白，将神经递质多巴胺从突触间隙泵出回细胞质[17]。因此，TH 和DAT 的表达在一定程度上代表了多巴胺能神经元的数量。免疫组化结果显示补肾止颤方中剂量组（10天）和高剂量组（20 天）中TH 和DAT 的表达较模型组明显升高（P＜ 0.01）（图2、表1）。另外，ELISA 结果同样显示补肾止颤方可以提高TH 和DAT 的表达水平，说明其能够促进多巴胺能神经元的表达（表1）。

多巴胺代谢过程中有许多代谢产物直接或间接影响帕金森患者的症状。DOPAC 是神经递质多巴胺的代谢产物，在单胺氧化酶和多巴胺儿茶酚-O-甲基转移酶（COMT）催化下降解为高香草酸（HVA），HVA可以反映大脑中的多巴胺水平，HVA 在脑脊液中的浓度与运动损伤相关，并且它可能是PD 期的合适标志物[18]。广泛的含5-HT 神经元网络涉及许多生理事件的调节，如激素分泌，睡眠-觉醒周期，运动控制，意识，学习，记忆等[19]。人们普遍认为5-HT 会引起幸福感[20]，且由于其复杂但关键的调节特性，5-HT 被认为是中枢神经系统的主要协调者之一，在运动活动中具有非常重要的作用[21]。因此，5-HT的减少可能会导致帕金森患者活动、记忆、睡眠障碍及抑郁情绪等症状的发生。单胺氧化酶B（MAO-B）是多巴胺分解代谢过程中的关键酶之一，催化芳基烷基胺神经递质的氧化并产生活性氧，可以导致细胞损伤[22]。本次研究结果显示：补肾止颤方可以促进PD 模型多巴胺代谢产物 5-HT、DOPAC 和 HVA 的表达水平，而降低 MAO-B水平（表2），一方面表明补肾止颤方可以增加帕金森病大鼠多巴胺能神经元数量，另一方面显示出其增效减毒的作用，具有一定的神经保护作用，契合了该药补肾治本的作用机制。

综上所述，补肾止颤方能够改善帕金森大鼠的行为学，增加帕金森病大鼠多巴胺能神经元的数量，并维持多巴胺能神经元功能，降低神经损伤，有较好的神经保护作用。