基于网络药理学探析参桃软肝丸治疗肝细胞癌的机制＊

何灿封 ，李穗晖

（1. 广州中医药大学第一临床医学院 广州 510405；2. 广州中医药大学第一附属医院 广州 510405）

原发性肝癌（primary hepatocellular carcinoma）是临床中最常见且恶性程度最高的肿瘤之一，其发生率和死亡率在我国肿瘤疾病中分别位列第4 位及第3位，肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是其中最主要的病理类型，约占85%-90%以上[1]。肝细胞癌起病隐匿，早期临床症状不明显，多数患者确诊时已属局部晚期或伴有远处转移，且多数合并肝炎、肝功能及凝血功能异常而无法进行手术，即使允许行手术治疗，术后5 年复发及转移率仍有40%-70%[1]，后续治疗效果不佳，预后极差。

参桃软肝丸是国医大师周岱翰治疗肝癌的经验方，主要由人参、桃仁、当归、仙鹤草、丹参、大黄、冬虫夏草、人工牛黄组成，具有健脾养肝、软坚消癥之功效，临床上广泛用于治疗肝细胞癌，特别是乙肝病毒相关性肝细胞癌。临床研究表明，参桃软肝丸对于中晚期肝癌患者具有稳定瘤体、提高生存质量的作用，并且在改善患者肝区疼痛、腹胀、纳呆、乏力症状有较好疗效[2]。目前在参桃软肝丸原方组成的基础上开发出参桃软肝胶囊[3]，药理研究表明参桃软肝胶囊或通过抑制癌细胞生长、诱导凋亡、抑制肿瘤新生血管形成及改善机体免疫等方面发挥抗肝癌作用[4]。

为了探析参桃软肝丸治疗HCC 的机制，本文将基于网络药理学技术，构建参桃软肝丸治疗HCC 的“多成分-多靶点”网络，通过基因功能和通路富集分析确定参桃软肝丸的药理活性，并使用分子对接技术进一步研究参桃软肝丸关键成分与关键靶标之间的相互作用，以期为参桃软肝丸的临床应用提供依据，并为今后深入的实验研究提供方向。

1 资料与方法

1.1 收集参桃软肝丸的活性成分及靶点

从中药系统药理学分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，http://www.tcmspw.com/tcmsp.php）中收集人参、桃仁、当归、仙鹤草、丹参、大黄、冬虫夏草、人工牛黄的成分，根据口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥ 30% 和类药性（drug-likeness，DL）≥0.18 进一步筛选出活性候选成分，并获取其相应的靶点，同时删除不含有靶点的活性成分。然后通过通用蛋白质数据库（universal protein，Uniprot，http://www.uniprot.org）将收集到的靶点转化为对应的基因名称（gene symbol），其中物种来源限制为人（“Homo sapiens”），删除物种来源不符合人的靶点。

1.2 筛选参桃软肝丸治疗HCC的潜在靶点

使用“hepatocellular carcinoma”作为关键词检索人类基因数据库GeneCards（https://www.genecards.org），获取与HCC 相关的疾病靶点后，与“1.1”中获得的靶点取交集，最终获得参桃软肝丸活性候选成分治疗HCC的潜在靶点。

1.3 成分-靶点网络构建

使用Cytoscape 软件（版本3.7.1）构建参桃软肝丸治疗HCC 的“中药-活性成分-靶点”网络，同时采用CytoHubba 插件对该网络进行关键成分分析。连接度（degree，是体现节点重要程度的参数，即节点间相连的路径数目），degree值高的活性成分被认为是参桃软肝丸治疗HCC的关键成分。

1.4 基因本体Gene Ontology, GO 分子功能和京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析

clusterProfiler 是R 语言中用于基因集合功能及通路途径富集分析和可视化的软件包。在R 语言（版本3.6.1）中调用clusterProfiler 包对“1.2”获取的靶点进行GO分子功能和KEGG通路富集分析，其中筛选条件为P＜ 0.001。

1.5 构建蛋白质互作网络及分析关键靶点

将“1.2”筛选获得的靶点导入蛋白互作网络分析平台 STRING 数据库（http://string-db.org/），其中物种来源限制为人（“Homo sapiens”），构建蛋白质互作（protein-protein interaction，PPI）网络，保存为“tsv”格式文件导出后，导入至Cytoscape软件，采用CytoHubba插件对该网络进行关键靶点分析，degree 值排名前5的靶点被认为是参桃软肝丸的活性候选成分治疗HCC的关键靶点。

1.6 分子对接

使用分子对接技术研究参桃软肝丸关键成分与关键靶点之间的相互作用，具体为分别从蛋白质结构数据库PDB（http://www.rcsb.org/）和有机小分子生物活性数据库PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下载靶蛋白结构及关键成分结构后，上传至CB-Dock在线分子对接网站（http://cao.labshare.cn/cb-dock/），CB-Dock 可自动识别蛋白潜在结合位点，计算中心和大小后自定义对接口袋大小，并使用内置的AutoDock Vina 软件进行分子对接，以及对对接后结构打分。完成上述操作后，使用R 语言的pheatmap 包绘制热图，并使用Maestro 11.9 软件对上述对接结果中Vina 对接分值最佳的受体-配体结构进行绘图。

2 结果

2.1 参桃软肝丸候选活性成分

从TCMSP中检索人参、桃仁、当归、仙鹤草、丹参、大黄、冬虫夏草、人工牛黄的成分，根据阈值OB ≥30%和DL ≥0.18 进一步筛选，并去除重复成分后，共筛选出符合条件的候选成分113个（表1）。

2.2 参桃软肝丸治疗HCC的候选靶点

汇总候选成分在TCMSP 中相应的靶点后，通过Uniprot数据库将靶点名称转换为相应的基因名称，并剔除重复及非人类靶点后，共获得271 个潜在靶点。检索GeneCards 数据库得到与HCC 相关的靶点共758个，前后两者取交集，最终获得参桃软肝丸候选活性成分的潜在治疗靶点共73个（表2、图1）。

2.3 构建中药-活性成分-靶点

使用Cytoscape 软件绘制参桃软肝丸治疗HCC 的“中药-活性成分-靶点”网络图，详见图2。该图直观反映了参桃软肝丸多成分、多靶点治疗HCC 的作用机制。CytoHubba 插件分析表明，quercetin（槲皮素）、luteolin（木犀草素）、kaempferol（山奈酚）是degree 值排名前三的活性成分，可认为是参桃软肝丸治疗HCC 的关键成分。

表1 参桃软肝丸候选成分的具体信息

表2 参桃软肝丸治疗HCC的潜在靶点

图1 参桃软肝丸治疗HCC靶点的筛选

2.4 GO分子功能富集结果

clusterProfiler 包对上述73 个潜在靶点基因的GO分子功能聚类结果表明，排名前30的富集结果涉及了细胞生长、细胞周期、细胞凋亡、抗氧化和多种蛋白激酶调节等多个分子功能的调节（图3）。

2.5 KEGG通路富集结果

clusterProfiler 包对上述73 个潜在靶点基因的KEGG 通路富集分析表明，P值排名前50 条通路主要有乙型肝炎、糖尿病并发症中的晚期糖基化终产物-晚期糖基化终产物受体（advanced glycation end products-receptor for advanced glycation end product，AGE-RAGE）信号通路、膀胱癌、胰腺癌、卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒感染、人巨细胞病毒感染、肝细胞癌、非小细胞肺癌、表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）酪氨酸激酶抑制剂耐药以及丙型肝炎等（图4）。

2.6 PPI网络图

通过STRING网站和Cytoscape软件对参桃软肝丸中治疗HCC 的73 个靶点进行PPI 分析并作图，CytoHubba 插件分析显示degree 值排名前5 的靶点依次为：蛋白激酶B（protein kinase B，PKB or AKT1）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase-3，CASP3）、血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、V-Jun 肉瘤病毒癌基因同源物（V-Jun sarcoma virus 17 oncogene homolog，JUN）、V-MYC 骨髓细胞瘤病毒癌基因同源物（V-Myc Myelocytomatosis Viral Oncogene Homolog，MYC），这些可认为是参桃软肝丸治疗HCC的靶点互作网络中的关键靶点（图5）。

图2 参桃软肝丸治疗HCC的中药-活性成分-靶点网络

图3 参桃软肝丸中治疗HCC靶点的GO富集条形图

图4 参桃软肝丸中治疗HCC靶点的KEGG通路富集条形图

2.7 分子对接

分子对接结果显示，槲皮素、木犀草素、山奈酚等3 个关键成分与AKT1、CASP3、VEGFA、JUN、MYC 等5个关键靶点对接的Vina 分值＜-7.0 的有13 对，其中Vina 分值＜-9.0 有3 对，表明大部分关键靶点与关键成分的结合能力较强，而AKT1 蛋白与木犀草素相互作用的Vina分值（即结合能）最佳，为-9.80 kcal·mol-1，具体对接结果（图6）。结合图7可以看出，木犀草素与AKT1 蛋白之间通过 3 个 π-π 键和 1 个氢键形成较为稳定结构。

3 讨论

图5 参桃软肝丸中治疗HCC靶点的互作网络

图6 分子对接结果

本研究采用网络药理学方法，构建了中药-活性成分-靶点网络，该网络表明了参桃软肝丸具有多成分、多靶点综合作用的特点，其中关键成分可能为槲皮素、木犀草素、山奈酚。槲皮素、木犀草素和山奈酚均属于植物来源类黄酮化合物，药理研究发现，它们对于HCC 具有抑制增殖、诱导凋亡以及抑制其侵袭、转移等方面的作用[5-8]。参桃软肝丸活性成分治疗HCC 所调控的靶点互作网络表明，该网络的关键靶点很可能为AKT1、CASP3、VEGFA、JUN、MYC。GO 分子功能和KEGG 通路分析阐明了参桃软肝丸多功能、多通路治疗HCC 的机制，相关的通路有乙型肝炎、丙型肝炎 、磷脂酰肌醇 3 激酶/蛋白激酶 B（phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B，PI3K/PKB or PI3K/Akt）信号通路、p53 信号通路、癌症中微小 RNA（MicroRNAs）、细胞程序性死亡配体 1（programmed cell death ligand 1，PD-L1）表达和细胞程序性死亡蛋白1（programmed cell death protein 1，PD-1）检查点途径、细胞凋亡、低氧诱导因子-1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）信号通路 、白介素 -17（interleukin-17，IL-17）信号通路、叉头框转录因子O（Forkhead box O，FoxO）信号通路等。

结合本文网络药理学预测结果以及相关文献回顾，参桃软肝丸治疗HCC 的潜在机制可进一步归纳为以下几个方面：

3.1 抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡

3.1.1 抑制AKT1蛋白激活

图7 AKT1蛋白与木犀草素之间相互作用的3D示意图

AKT1（即AKT）是PI3K/AKT信号通路中重要的下游靶标，属于丝氨酸/苏氨酸激酶家族，该家族蛋白参与生长因子、细胞因子等激活下游靶标的细胞信号的转导[9]。AKT1 可通过抑制细胞凋亡而促使细胞存活[10]。AKT1的异常激活存在于多种癌症中，可促进癌细胞的代谢、生长、增殖、存活以及血管生成[11]。AKT1的磷酸化激活被认为是HCC 侵袭性和预后不良的危险因素[12]。研究表明，参桃软肝丸可通过抑制AKT1的磷酸化激活而发挥治疗HCC 作用[13]。分子对接结果表明，AKT1 蛋白与槲皮素、木犀草素和山奈酚对接的结合能均小于-9.0 kcal·mol-1，提示 AKT1 蛋白很可能是槲皮素、木犀草素和山奈酚的潜在靶标。目前槲皮素、木犀草素、山奈酚被发现均可抑制人肝癌细胞中AKT 蛋白的磷酸化激活，诱导细胞凋亡以及抑制肿瘤细胞的侵袭[14-16]。因此，参桃软肝丸治疗HCC 的机制之一很可能为槲皮素、木犀草素、山奈酚与AKT1蛋白结合后，抑制了其磷酸化激活，部分阻断了PI3K/AKT信号通路，从而抑制HCC细胞的增殖。

3.1.2 抑制c-Jun蛋白表达

JUN 是细胞增殖过程中重要的转录因子，在HCC中可通过拮抗抑癌基因p53 的活性，协助HCC 细胞逃避细胞凋亡[17]。JUN 蛋白家族包括了 c-Jun、Jun-B 以及Jun-D。体外实验表明，槲皮素和山奈酚可分别抑制胃癌、前列腺癌细胞[18,19]与肺癌、肾癌细胞[20,21]的c-Jun 蛋白表达而诱导肿瘤细胞凋亡，抑制其增殖和侵袭。

3.1.3 激活CASP3蛋白

CASP3 是细胞凋亡级联反应中位于下游的半胱氨酸蛋白酶，被激活的CASP3 通过裂解和破坏细胞结构以及断裂DNA 执行细胞凋亡过程[22]。研究发现，槲皮素、木犀草素及山奈酚可通过多种机制激活CASP3蛋白，进而诱导人肝癌细胞的凋亡[8,23,24]。

3.1.4 抑制Myc蛋白表达

Myc 属核蛋白类的原癌基因，编码的转录因子与核DNA 结合后促进细胞增殖[25]，c-Myc 是该家族的重要成员，多数HCC 存在c-Myc 过表达，其异常激活可促使肝细胞癌的发展[26]。研究发现，槲皮素、木犀草素及山奈酚可降低c-Myc 蛋白水平而促进多种肿瘤细胞凋亡[27-28]。此外，槲皮素被报道能与c-Myc 基因启动子区域相互作用而形成稳定结构，或为潜在的抗肿瘤候选药物[29]。

3.1.5 调控miRNA

miRNA 属于非编码RNA，可调节基因表达。HCC中常有miRNA的失调，miRNA可通过靶向大量关键蛋白的编码基因，促进HCC 细胞增殖和转移，同时逃避细胞凋亡[30]。木犀草素目前被发现可调控多种miRNA而发挥抗肿瘤作用[31,32]。

3.2 抑制肝炎病毒基因表达

乙型肝炎、丙型肝炎以及肝硬化是肝癌发展的主要危险因素[33]，其中引起乙型肝炎和丙型肝炎的乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）和丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）同时也是引起HCC 的重要致癌因素。在全球范围内，78%的HCC 归因于HBV（53%）或HCV（25%）[34]。KEGG 结果表明，参桃软肝丸治疗HCC 的靶点的通路富集结果包括了乙型肝炎和丙型肝炎。研究发现，乙型肝炎病毒X 基因（Hepatitis B Virus X gene，HBx）是HBV 上最小的开放读码框，可影响HBV 的复制以及导致肝癌的发生和发展[35]，参桃软肝丸在HBV 相关的HCC 患者中可通过促进HBx 启动子的甲基化抑制HBx的表达，从而发挥抑瘤功效[36]。

3.3 抑制肿瘤新生血管生成

在缺氧情况下，HCC 组织中上调的HIF-1 会诱使VEGF 产生，而VEGF 是促进HCC 新生血管生成的主要因素[37]。研究表明，参桃软肝丸治疗HCC 的作用机制之一是通过抑制肝癌组织VEGF 的表达，减少肿瘤新生血管的生成，延缓肿瘤的侵袭、转移[4,13]。

综上，本研究初步表明，参桃软肝丸具有多成分、多靶点和多通路治疗HCC 的作用模式，其潜在机制涉及了抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡、抑制肝炎病毒基因表达和抑制肿瘤新生血管生成等方面，目前仍有部分通路和机制尚未得到实验验证，但这可为今后阐明参桃软肝丸治疗HCC 的具体机制提供思路，也可为参桃软肝丸临床治疗HCC提供更多依据。同时，槲皮素、木犀草素和山奈酚与AKT 蛋白均有较好的亲和性，这可为筛选新型治疗HCC的靶向药物提供一定参考。