基于肝脏微结构的猪肝祛毒方法的建立和祛毒猪肝食品的初步研发

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(1 山东省数字医学与计算机辅助手术重点实验室，青岛大学附属医院，山东 青岛 266003；2 山东省数字医学临床诊疗与营养健康协同创新中心；3 青岛大学附属医院小儿外科；4 青岛大学附属医院手术室；5 青岛大学公共卫生学院；6 青岛大学附属医院内分泌科;7 青岛万福集团股份有限公司)

肝脏是机体储存营养物质的重要器官。猪肝富含维生素A、蛋白质及铁、锌、硒等矿物质，是儿童、孕妇、老年人、贫血人群、呼吸道感染患者等特殊人群补充营养的必备食品[1]，可为提升人体免疫力提供重要物质保障[2]，也常被营养学家推荐食用[3]。然而，肝脏也是机体重要的解毒器官，许多学者在肯定猪肝营养价值的同时，也表示了对猪肝残留毒素的忧心[4-6]。营养学家建议猪肝在烹调前必须彻底清洗干净[6-7]。

从肝脏正常代谢和肝脏微结构形态来看，动物肝脏中内毒素及病原菌的含量远比肌肉高[8-9]。肝脏“解毒”主要是依靠肝脏内的枯否细胞(Kupffer细胞)和其他免疫细胞吞噬肝脏中的内毒素和病原菌[10-11]，这些“吞噬”毒素的枯否细胞和其他免疫细胞主要聚集在肝脏内肝血窦中的血液中[12]，如不将肝血窦中的血液清除干净，就无法实现猪肝最大程度“祛毒”。据文献报道，猪肝祛毒常用的方法有整体浸泡法和切片清洗法[6]。虽然，上述方法有一定的祛毒作用，但肝脏离体后，部分血液会快速凝固在微小的肝血窦中，无法实现彻底清除，因此并不能最大程度地祛除毒素。

肝脏灌注是活体肝移植手术中较常用的肝脏保存方法[13-14]，然而能否利用肝脏灌注实现生鲜猪肝祛毒，目前尚未见相关报道。本研究利用肝脏灌注技术进行猪肝祛毒，通过肝脏超微结构三维重建图像来评价祛毒效果，利用感官品质评分方法评价灌注祛毒方法对猪肝性状和口感的影响，最后利用祛毒猪肝初步开发相关产品。

1 材料与方法

1.1 主要材料

新鲜猪肝由青岛万福集团股份有限公司提供。

1.2 仪器与试剂

灌注液为含有1 g/L柠檬酸钠的生理盐水；苏木精-伊红(HE)染色液(北京九州柏林生物有限公司)；自制流量可控灌注泵、灌注台、灌注管和灌注头各一套；全自动脱水机ASP300S(Leica，德国)；切片扫描显微镜(Nikon，日本)。

1.3 新鲜猪肝祛毒方法

所有猪肝灌注祛毒过程均在青岛万福集团股份有限公司猪屠宰产线旁进行。猪肝在离体后1 min内实施灌注处理。取表面被膜完整的生鲜猪肝平铺于灌注台上，立即将灌注液通过门静脉和肝动脉血管灌注，直至肝静脉流出的灌注液清澈、肝脏表面呈黄白色无花斑为止。灌注在亚低温(20 ℃)条件下进行，灌注流量设置为280 mL/s。猪肝灌注完成后，切除胆囊，置于4 ℃控水过夜待用[15]。传统浸泡法祛毒猪肝按文献方法制备[6]。

1.4 猪肝微结构三维重建和祛毒效果评价方法

1.4.1猪肝微结构图像采集 取灌注清洗后距离肝脏表面0.5 cm的肝实质，切成约1 cm3小块，放置于4%多聚甲醛液中固定(过夜)，梯度乙醇脱水，石蜡包埋，4m厚切片。在40 ℃温水中展片、捞片后烘干，HE染色，常规脱水、透明、封片后晾干。最后用切片扫描显微镜收集图像数据。

1.4.2猪肝微结构三维重建 先将所有图像利用基于B样条的形变配准方法进行配准。将配准后图片输入VTK三维重建工具包进行重建，重建后对图像进行着色和渲染，模型建立后保存。

1.4.3猪肝祛毒效果评价 利用猪肝微结构二维显微图像和三维图像，观察猪肝肝细胞形态和猪肝肝小叶内所有微血管、肝血窦等微结构的洁净程度，来判断灌注祛毒方法的有效性。

1.5 祛毒猪肝食品加工制作方法

1.5.1卤猪肝制备方法 取经传统浸泡法祛毒处理生鲜猪肝和经灌注祛毒处理生鲜猪肝各2个，分别在两个蒸汽夹层锅中同时加料卤制至全熟，捞出晾凉，去除大血管，用切片机将猪肝1 cm厚切片，将长宽均小于5 cm的猪肝小块装袋，每袋3～5片，高温高压杀菌备用。

1.5.2无淀粉猪肝火腿(简称猪肝火腿)和维也纳猪肝香肠(简称猪肝香肠)制备方法 取猪肉和鸡肉按质量分数为0.65∶0.35制作猪肝火腿和猪肝香肠的配料，取经灌注处理生鲜猪肝，制作3种不同猪肝含量的馅料作为3个实验组，即猪肝和配料质量分数分别为0.15∶0.85(A组)、0.25∶0.75(B组)和0.35∶0.65(C组)来制作最终的灌装用馅料。馅料加调味料斩拌后，进行灌装-蒸煮-封装-灭菌处理。在研发初期，猪肝火腿和猪肝火腿及香肠灌装馅料相同，猪肝火腿使用纤维素肠衣，每根350 g，猪肝香肠使用羊肠肠衣，每根50 g。

1.6 祛毒猪肝产品感官品质评价方法

新冠肺炎疫情期间，猪肝火腿和猪肝香肠产品被送至武汉，为前线医护人员提供一定的膳食营养保障，同时设计简单问卷调查，对131名武汉新冠肺炎抗疫医护人员和307名普通人群进行了问卷，初步评判猪肝火腿和猪肝香肠产品的大众接受度。产品问卷以微信小程序形式推送，所有问题为单选。具体评分内容和标准见表1～3。

表1 卤猪肝感官品质评价标准

表2 猪肝火腿及香肠感官品质评价标准

表3 祛毒猪肝产品接受度调查问卷

2 结 果

2.1 猪肝肝小叶微结构三维重建结果

通过对灌注清洗猪肝肝小叶的三维图像重建，观察发现猪肝肝小叶的形态呈典型的多面棱柱状(图1A)，内部微型管路清晰可见，被测猪肝肝小叶直径约1.5 mm。肝小叶三维重建模型可以任意角度旋转观察肝细胞状态以及微小血管管路、肝板、肝血窦等微结构的情况(图1B、C，视频1)。

2.2 猪肝祛毒效果评价

与未处理猪肝(图2A)相比，经灌注祛毒后的猪肝呈黄白色(图2B)，两者有明显差别。经灌注祛毒后，猪肝质量增加约0.5 kg，经4 h控水后，猪肝质量减轻至初始值。

经猪肝组织切片观察，浸泡祛毒的猪肝肝血窦内仍然存在大量的血细胞和含有内毒素的巨噬细胞等杂质(图3A)；猪肝经过灌注祛毒后，肝窦内部未见血细胞和其他杂质(图3B、C)，经高倍显微镜图像(图3C)和三维重建图像(图3D)观察猪肝细胞形态良好，高灌注压和亚低温灌注对猪肝细胞无影响，且灌注祛毒猪肝肝小叶内部微血管等微结构内部也未见血细胞和巨噬细胞等杂质。

A：肝小叶三维立体图；B：肝小叶表面局部放大图；C：肝小叶血管局部放大图像

A：未祛毒猪肝；B：灌注祛毒猪肝

2.3 猪肝灌注祛毒对猪肝性状、口感等的影响

A组色泽、软硬度、腥味以及苦味平均得分显著低于B组(t=4.97～22.87，P<0.01)；B组的综合评分显著高于A组(t=25.89，P<0.01)。见表4。

2.4 猪肝火腿和猪肝香肠的感官品质评价结果

A、B以及C组综合评分分别为(73.47±1.67)、(77.33±2.63)、(56.60±2.63)分，3组比较差异有显著性(F=46.35，P<0.01)；B组综合评分与A组比较差异无显著性(P>0.05)；A、B组综合评分与C组比较差异有显著性(P<0.01)。

A：10倍物镜观察下浸泡祛毒猪肝组织切片；B：10倍物镜观察下灌注祛毒猪肝组织切片；C：40倍物镜观察下灌注祛毒法猪肝组织切片；D：猪肝肝小叶血管内壁细胞立体结构
图3 猪肝微结构的二维和三维图像

表4 两种卤制猪肝各项指标以及综合评分结果比较(n=30，分，

2.5 祛毒猪肝火腿和猪肝香肠产品初步调查问卷结果

对猪肝质量分数为0.25的猪肝火腿和猪肝香肠产品进行了问卷，97%医护人员和普通人群认为两款猪肝产品口感好；61%的人认为猪肝香肠口感更好；67%的人认为可以尝到猪肝的香味；83%的人认为两款猪肝产品没有腥味，16%的人认为两款猪肝产品有一点腥味，1%的人认为两款猪肝产品腥味大；91%的人认为两款猪肝产品没有苦味，9%的人认为有一点苦味。

3 讨 论

本研究通过对猪肝超微结构二维和三维重建图像观察，证明猪肝灌注清洗方法可以有效地清除肝血窦内的血液，从而有效地祛除肝窦血液内含有毒素的枯否细胞和其他免疫细胞。不同于传统肝脏三维重建方法[16-17]，本研究采用的微结构三维重建算法能够立体、多角度展现肝脏微小结构，从而可以直观地评价猪肝祛毒效果。

与临床中器官移植肝脏灌注方法[14]相比，本研究对生鲜猪肝灌注的目的是在不破坏肝细胞形态的前提下祛除肝脏内毒素，不考虑肝细胞的活性及各类酶的水平，因此选用的灌注液成分较为简单。另外，本研究中使用的灌注流量是临床肝脏灌注流量的28倍[18]，高流量冲洗能够快速清除猪肝细胞间隙内残存的血液等杂质，组织学分析结果证实高流量灌注没有破坏猪肝细胞的形态结构，这为祛毒猪肝批量生产提供了充分的实验依据。

猪肝富含维生素A。研究表明维生素A对保护和修复呼吸道黏膜组织具有非常重要的作用[19]。当体内维生素A水平下降时，鼻、咽、喉和其他呼吸道黏膜角质化，导致机体易被细菌侵袭和感染，特别是婴幼儿，可由此引发支气管肺炎，严重者会导致呼吸衰竭死亡[20-21]。另外，猪肝内还含有丰富的优质蛋白质、B族维生素及铁、锌、硒等营养元素，对提高人体免疫力也有非常重要的作用[2]。新冠肺炎疫情期间，在膳食中适当增加猪肝的摄入，对抗击疫情具有一定的辅助作用。本研究制作的猪肝质量分数为0.25的猪肝火腿和猪肝香肠被送往武汉，为医护人员补充膳食营养，得到医护人员的一致好评。

本研究感官评价结果表明，经灌注祛毒的猪肝色泽和口感都有极为显著的改善，为猪肝食品的研发奠定了实验基础。问卷调查显示，医护人员与普通人群对两款祛毒猪肝产品评价良好，从数据来看两款猪肝产品不论口味还是产品形式，都得到被调查人员一定程度的认可，这为祛毒猪肝产品产业化奠定了实验基础。本文采用的生鲜动物肝脏祛毒技术，以及基于祛毒动物肝脏的食品加工方法、婴幼儿辅食食品加工方法以及老年人保健食品加工方法等内容已获得4项中国及2项国际专利保护[15,22-26]，这对产品扩展研发和向国内外市场转化都有非常重要的意义。本研究是祛毒猪肝技术和相关产品研发的初步实验研究，今后将重点对祛毒猪肝含有营养素的情况，以及基于祛毒猪肝的婴幼儿辅食、老年人干粉等产品展开深入的研究。

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