基于网络药理学和分子对接技术探讨自拟“清瘟汤”治疗新型冠状病毒肺炎的机制*

马诗瑜，方 洁，卞晓岚△，杨 铭，郑 岚，郑 林

（1.上海交通大学医学院附属瑞金医院，上海200023；2.上海中医药大学附属龙华医院，上海200032；3.上海中医药大学附属光华医院，上海200003）

临床实践显示，中医药及中西医结合治疗新型冠状病毒肺炎（简称新冠肺炎，COVID-2019）成效明显，在疫情防控中发挥了重要作用。武汉市首个以中医治疗为主的方舱医院患者观察数据显示，与单纯西医治疗相比，中西医结合治疗患者的临床症状消失时间（5.15 d）少2 d，体温恢复时间（2.64 d）少1.7 d，平均住院时间少2.2 d，CT影像好转率高22%，临床治愈率高33%，普通转重症比率低27.4%[1]。瑞金医院中医科自拟“清瘟汤”（QWT），主要由贯众、大青叶、板蓝根、金银花、蒲公英、金荞麦、藿香、黄芪、防风、白术、甘草11味中药组方，发挥益气固表、祛湿排毒功效，疫情前已在瑞金医院感染科重症监护室（ICU）使用，对病毒性肺炎患者疗效良好。新冠肺炎中医辨证为“湿毒疫”，主要病位在肺。根据《温病条辨》《伤寒论》等医学著作，结合实际辨证论治，目前QWT已在瑞金医院援助的武汉同济协和医院（光谷院区）、孝感市中心医院、随州市中心医院、武汉大学附属中南医院等使用，取得了较好的临床效果。

网络药理学的研究策略主要是从系统性和整体性的特点来研究中药复方的多成分、多靶点、多途径的协同作用，从而阐明药物作用机制[2-9]。分子对接技术是一种较成熟的发现新药的技术手段，采用计算机辅助进行药物设计，通过化学计量学模拟分子的作用力和结构，寻找小分子（或配体）与已知结构的大分子（或受体）活性位点的低能结合模式[9]。本研究中基于网络药理学技术和分子对接技术探讨QWT对新型冠状病毒（SARS-CoV-2）的作用机制，为进一步合理控制疫情及使用中药提供理论基础。现报道如下。

1 研究方法

1.1 疾病及相关基因信息数据库建立

1.2QWT化学成分及作用靶点数据库建立[4-8]

化学成分筛选：通过搜索5个开源的数据库（TCMID，CHEMBL，TCMSP，HIT，STITCH），得到QWT的相关活性成分及作用靶标数据，并使用NCBI数据库的Gene基因搜索功能对靶点信息进行标准化。使用了类药性描述符（QED）对化合物的吸收、分布、代谢、排泄（ADME）性质进行筛选[4-8]，QED整合了8个重要的分子描述符，设定的化合物类药性指数阈值为0.2，大于0.2的类药性成分纳入网络药理学分析。

表1SARS-CoV-2的相关基因

作用靶标筛选：按照公式（1）计算复方作用靶标GS，其中分子与分母分别表示靶标与k个以上活性成分具有相互作用概率的负对数及按升序排列的秩次，P值越小相对应的GS值越大，而P≥0.05时相应的GS值为0。按照二项分布理论以P（X≥k）表示靶点与k个以上活性成分具有相互作用的概率值[公式（2）]进行筛选，公式（2）中n是活性化合物总数，g是平均每个靶标相互作用的活性化合物数，k为当前靶标相互作用的活性化合物数。当靶标P≤0.05时，说明该靶标与k个活性成分相互作用是小概率事件，则该靶标可以认为是复方的主要作用靶标。最终得出GS得分不为0的基因，即主要作用靶标。

活性成分筛选：在GS值基础上，进一步采用复方作用靶标得分的GS值[公式（3）]进行筛选，式中GS是活性化合物i的靶标基因得分，Ni是活性化合物i的靶标基因数，I是指示变量，活性化合物i的得分等于其相应靶标得分的均值。通过GS值，可最终发现与复方中有效成分作用最相关的靶点。

上述工作由中药网络药理学分析系统完成，TCMNPAS（TCM networkpharmacologyanalysissystem）国家计算机软著登记号：2019SR1127090。

1.3 生物靶标网络模型构建和分析

采用String V11.0软件构建QWT靶标的蛋白质相互作用（protein-protein interactoin）网络，物种设置为“Homo Sapiens”，最低阈值设置中等置信度“Medium confidence”为0.4。使用Cytoscape 3.7.0软件计算相应的拓扑参数值进行筛选，使用MCODE功能对PPI网络进行模块分析，设置K-core值需大于4。

1.4 生物功能分析

对靶标基因生物功能分析主要有3个层次，即基因本体（GO分析）、信号通路（pathway）及医学主题词（Mesh），采用超几何分布模型P值，评估靶标基因是否与特定的基因本体、信号通路及主题词显著关联，同时还有经过False Discovery Rate（FDR）法调整的P值，反映靶点群与基因本体、信号通路的关联强度，以调整的P＜0.01为关联最显著。

基于网络的QWT作用于疾病靶标相关性分析，使用最短路径长度评估QWT作用靶标与疾病的相关性，以P值判断；显示复方靶标与疾病靶标的关联程度，按P值显著性排序关联程度最高的GO术语、KEGG通路。

1.5 分子对接试验方法[9]

从QWT的有效成分中，选取等级值（degree，等级值越高，说明其在网络拓扑关系中作用越重要）最高的活性成分（27种），与SARS-CoV-2的3C类似蛋白酶（3CLpro，PDB ID：6Lu7）和天然人类血管紧张素转换酶相关的羧肽酶（ACE2，PDB ID：1R42.）进行分子对接。从RCSB数据库（https：//www.rcsb.org/）下载相关蛋白的结构，从ChemicalBook数据库（https：//www.chemicalbook.com/）下载化合物结构，使用Pymol软件去除溶剂分子与配体，使用AutoDock软件进行加氢、加电子、加ROOT等操作，完成后进行分子对接，其中蛋白结构的设置为刚性大分子。使用算法为Local Search Parameters，得到结果（蛋白结构）中每个蛋白结合能最低的两组，使用Pymol软件对得到的最佳结果（蛋白结构）进行绘图。

确实，驮子对我们村里人是大方的。一般村里人去他那儿弹棉花，算钱的时候，只要有零头他全会抹掉，哪怕是九块头的。比如，五十九块，他就会说，五十块好了。再比如，过年过节的，驮子也会给村里人送一些小枕头啊，小坐垫啊。尽管这些东西不是太值钱，但我们岭北人是懂得感恩的。我们岭北人就用语言东传传西传传，把个驮子说得跟圣人下凡似的好。

2 结果

2.1QWT化学成分及作用靶点数据库建立

共获得QWT中活性成分172个及主要靶标480个，详见表1。根据组成QWT的归经信息，构建复方的中药-归经网络及重要活性成分-靶标网络。详见图1和图2。

表1 QWT中各药材活性成分与对应366个靶标成分数量（个）

图1 QWT“中药-归经”网络图

图1和图2中每个节点的大小代表了其等级值（表示该节点和网络中其他节点相连的路线条目，等级值越大代表该节点是连接其他节点的重要桥梁），颜色由冷到暖代表了中心度值（betweenness centrality），连线的粗细和颜色代表了Edge betweenness，所有的颜色和粗细都是越大越粗，越大越暖色。由图1可见，等级值较大的依次为胃经、肺经、脾经，等级值分别为10，5，5，说明大多数中药归属此三经。

对QWT中172个活性成分及480个主要靶标构建QWT活性成分-靶点网络图，共609个节点、2 556条边，筛选其中等级值≥20的活性成分有27种，详见表3；等级值≥30的靶标共有89个，详见表4。绘制27种重要成分与靶点间的网络图（图2）可知，与靶标相关的主要活性成分主要分为两类，一类是清热解毒药中抗炎、抗菌、抗病毒的有效成分，另一类主要是扶正固表药中提高免疫的氨基酸成分。

2.2QWT靶标干预的生物功能分析

将480个作用靶标进行通路及基因本体的富集分析。QWT与SARS-CoV-2在GO水平上显示出共关联性，在前400个主要关联的GO分类中两者共关联占比达73.60%。在P＜0.01水平上，与两者显著共关联的GO分类主要有4类作用：1）抗炎作用（积极调控发热、干扰素γ产生的正向调节、IL-12产生的正向调节、IL-6产生的正向调节、细胞对肿瘤坏死因子的反应、I-κB激酶/NF-κB信号传导、NIK/NF-κB信号）；2）免疫作用（α-βT细胞活化、B细胞活化参与免疫反应、免疫球蛋白的生成、白细胞参与免疫反应、淋巴细胞活化参与免疫反应、单核细胞趋化、巨噬细胞趋化性的正调控、T细胞活化的正调控）；3）血管生成作用（肾素-血管紧张素调节血容量、血管生成）；4）钙离子通道作用（胞浆钙离子浓度的正调控、钙离子稳态、钙离子转运的正向调节、钙离子进入的正调控）。其中钙离子通道作用与血管生成作用之间互相作用，免疫调节作用与抗炎作用之间也相互关联。

KEGG富集分析（图3）显示，在P＜0.01水平上，QWT靶标与132条信号通路显著关联，与SARSCoV-2关联为36条，与两者均有关联为26条。在两者均有关联的26条通路中，KEGG通路富集结果中限定为人类疾病部分的通路，得到14条靶标富集的疾病通路，其中有12条通路与感染性疾病、肺部疾病及免疫疾病相关，包括疟疾、阿米巴病、军团菌病、单纯疱疹病毒感染、乙型病毒性肝炎、丙型病毒性肝炎、百日咳、甲型流感、肺结核、类风湿关节炎、同种异体移植排斥。其他通路主要与抗炎及免疫相关，包括主要作用于肿瘤坏死因子（TNF）信号通路、白细胞介素17（IL-17）信号通路、核转录因子（NF-κB）信号通路、TLR多蛋白复合体（Toll）样受体信号通路、辅助T细胞17（Th17）细胞分化T细胞受体信号通路、趋化因子信号通路、细胞因子与细胞因子受体的相互作用、NF-κB信号通路、NLR蛋白（NOD）样受体信号通路、T细胞受体信号通路、产生IgA的肠道免疫网络。

表3 QWT中与靶标最相关的重要活性成分

表4 QWT中等级值较高的靶标

2.3QWT和SARS-CoV-2的生物PPI网络分析

使用String在线平台对QWT的作用靶标进行PPI网络构建，PPI网络包含419个蛋白质节点、21 519条边。根据PPI结果进一步进行网络分析和计算，选取等级值≥100的节点，主要包括CXCL8，CXCR4，CXCL12，APP，CXCL1，AGT，CXCL10，KNG1，POMC，CCR5，CCR2，CXCL2等200个靶点，对高等级值的靶点进一步进行PPI分析。Stirng功能富集分析结果中，设定统计指标为FDR＜1×10-6，在KEGG通路富集的结果中发现，高等级值蛋白主要影响的KEGG疾病通路与感染性疾病、肺部疾病、免疫疾病、心血管疾病相关，包括肺结核、人嗜T淋巴细胞病毒-I（HTLV-I）感染、乙型病毒性肝炎、百日咳、军团菌病、沙门菌感染、扩张型心肌病、动脉粥样硬化、类风湿关节炎、阿米巴病、甲型流感。主要影响的信号通路有NOD样受体信号通路、Toll样受体信号通路、IL-17信号通路、TNF信号通路、血管平滑肌收缩等。同时，对高等级值靶点的PPI网络进一步使用网络模块功能分析（MCODE）进行模块分析，共得到2个子网络模块。详见图4。其中模块1的靶点主要与免疫系统（图中所示紫色）、抗炎（TNF信号通路，图中所示绿色；MAPK信号通路，图中所示黄色；白细胞介素信号，图中所示红色）相关；模块2的靶点主要与细胞转录（图中所示红色）和RNA聚合酶Ⅱ特异的DNA结合转录因子结合（图中所示紫色）相关。

2.4 分子对接结果

QWT中主要的27种活性成分与3CLpro和ACE2的对接结果见表5。其中，每个蛋白对接最好的前5位化合物的对接结果见图5。5种化合物均能与2种蛋白形成氢键，其中异鼠李素均能与2种蛋白形成5个氢键；槲皮素能与3C类形成5个氢键，与ACE2结合形成2个氢键；芹菜素能与3C类形成4个氢键，与ACE2结合形成3个氢键；熊果酸均能与2种蛋白形成2个氢键；羽扇豆酚均能与2种蛋白形成1个氢键。

表5 QWT中活性成分的分子对接结果

3 讨论

本研究中对QWT的活性成分、归经、靶标及生物功能均进行了分析，并通过分子对接技术对直接作用于SARS-CoV-2的2种蛋白进行了对接，希望为进一步抗SARS-CoV-2治疗提供支持。

新冠肺炎属中医“疫”范畴，病因为感受疫疠之气，主要为“湿毒”疫气，病位在肺，但前期的许多研究发现[12]，多数患者有消化道症状。QWT主要作用于胃经、肺经、脾经，方中有10味中药作用于胃经，有5味中药作用于肺经和脾经。说明QWT对于改善脾胃症状有较好作用，同时作用于肺经，祛湿和胃，调节胃肠道功能，共同改善肺部症状。

网络药理学研究发现，QWT中最相关的活性成分是琥珀酸、香豆素、γ-氨基丁酸、谷氨酰胺、槲皮素、山柰酚、脯氨酸、赖氨酸、木犀草素、色氨酸、L-缬氨酸、胆碱、芹菜素、β-谷固醇、苯丙氨酸、丙氨酸、水杨酸、DL-缬氨酸、羽扇豆酚、腺苷、谷氨酸、熊果酸、大黄素、异鼠李素、黄豆苷元、柠檬酸、阿魏酸。其中主要为4类成分：1）黄酮/黄酮苷元等清热解毒中药中常见的有效成分，槲皮素、山柰酚、异鼠李素、木犀草素、芹菜素、黄豆苷元；2）五环三萜类的抗炎有效成分，熊果酸、羽扇豆酚；3）有机酸类有效成分，阿魏酸、琥珀酸、水杨酸、柠檬酸；4）氨基酸类成分，如赖氨酸、脯氨酸、色氨酸、丙氨酸、缬氨酸、谷氨酰胺等。山柰酚、槲皮素、木犀草素、芹菜素是经典的抗炎和抗菌有效成分，以上几种成分目前在抗炎、抗病毒、抗肿瘤、心血管保护、免疫调节等研究中也被报道有一定作用。山柰酚和槲皮素均能降低人肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、细菌内毒素和白细胞介素（IL）-1β的刺激等的表达[13-14]。槲皮素对疱疹病毒感染机体后的增殖具有抑制作用，也可拮抗病毒诱导的细胞凋亡[15]。木犀草素[16-19]和芹菜素对抗病毒均有一定作用，芹菜素更是已有发明专利涉及其用于预防和/或治疗中东呼吸道综合征冠状病毒（MERS-CoV）感染的药物组合物[19]。熊果酸作为经典的保肝有效成分，除了能抑制乙型肝炎病毒转录用于病毒性肝炎[20]外，对疱疹病毒也有作用[21]。黄豆苷元能有效抑制老年冠心病患者血清炎性因子水平（hs-CRP，IL-6，TNF-α），对冠状动脉粥样硬化具有抗炎作用[22]。大黄素作为常见蒽醌类成分，体内及体外试验中均表现出了抗炎活性，与其阻滞低氧诱导因子-1α（HIF-1α）/NF-κB-COX-2信号通路相关[23]。氨基酸类的有效成分主要发挥调节免疫作用，提高患者的免疫功能。多种活性成分协同作用，对于患者的抗炎、抗病毒、保肝、增强免疫力等多方面提供治疗支持。

图2 QWT中重要活性成分-靶标网络图[3]

图3 KEGG富集分析

图4 高节点数PPI的MCODE模块分析

图5 分子对接结果[5]

QWT与SARS-CoV-2，在生物功能、KEGG通路作用中，以及PPI互作网络中，最为相关的信号通路主要为：IL-6免疫反应、IL-17信号通路、NOD样受体信号通路、Toll样受体信号通路等，最相关的疾病聚集主要为百日咳、甲型流感、类风湿关节炎、疟疾等。由于新冠肺炎目前没有特效药物，发病早期患者的外周血白细胞总数正常或减低，淋巴细胞计数减少，提示免疫功能改变，因此应用中药调节免疫功能显得尤为重要。在重症肺炎中就有报道，对炎性因子的调控与预后具有相关性[24]，PCT，CRP，TNF-α，IL-6水平均能较好地预测病情进展及急性呼吸窘迫综合征（ARDS）的发生，提示QWT可能通过相关的炎症通路来进一步避免炎性介质的进一步释放。Toll样受体和NOD样受体均为与自身免疫疾病相关的受体[25]，QWT通过调节两者的信号通路，可以影响自噬和抗炎，自噬可影响感染炎性疾病的缓解和炎症性疾病的病理过程。此外，新冠肺炎患者可能出现心功能损害，QWT的靶标可能影响肾素-血管紧张素调节血容量、调节血液循环、对钙离子通道中的胞浆钙离子浓度起正调控等，说明QWT有潜在的心血管保护作用，可能在一定程度上减轻患者的心脏负担，改善心功能。

在分子对接结果中发现了5种活性成分（异鼠李素、槲皮素、芹菜素、熊果酸、羽扇豆酚）均能与SARSCoV-2的S蛋白和人体内血管紧张素转换酶Ⅱ（ACE2）蛋白结合并形成氢键，说明其有潜在的成药性，可能需要进一步的药效学验证。现阶段的研究认为[26]，使用ACEI或者ARB类药物可能是一把“双刃剑”，而和中药的配合使用，可能有“减毒增效”之功用。本研究中还发现，QWT与SARS-CoV-2最相关的5个靶标可作用于疟疾和类风湿关节炎，提示中药制剂与氯喹的联合使用可能进一步改善新冠肺炎的治疗。

综上所述，本研究中采用网络药理学的技术手段和分子对接技术，对自拟QWT的活性成分、归经和靶标进行了系统性研究，阐释了其对SARS-CoV-2的分子水平作用机制，突出了中药制剂多成分、多靶标对机体整体调控的特点，为该复方制剂治疗新冠肺炎提供了理论支持。